嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。     

康定贡嘎蝠蛾的生物学特性

贡嘎蝠蛾Hepialus gonggaensis是冬虫夏草菌的寄主昆虫之一,为了人工饲养蝠蛾培殖冬虫夏草,提供科学依据。从1980—1985年,在四川康定贡嘎山干沟基点(海拔3800m)的自然条件下和室内,对贡嘎蝠蛾的生物学特性进行了系统的观察研究,现将结果报告于后。     

药用级微生物谷氨酰胺转胺酶的纯化工艺研究

为了提高谷氨酰胺转胺酶的纯度和扩展在医药领域的应用,探索了一种适合工业化生产的、安全高效的微生物谷氨酰胺转胺酶纯化方法。轮枝链霉菌发酵后,经离心10 000 r/min 4℃除去菌体,调节发酵液电导率至4.1mS/cm和pH6.0后,以直线流速60cm/h通过SP Sepharose FF阳离子交换层析柱对目的蛋白高 选择性和高载量地捕获,再通过phenyl sepharose 6 FF（high sub）疏水层析柱进行精细纯化。纯化后经SDS-PAGE鉴定纯度达到95%以上,HPLC分析纯度> 99%。鲎试剂测定内毒素含量为0.013EU/ml,达到中国药典中血制品要求的低于0.15EU/ml标准。     

海拔对大熊猫主食竹结构、营养及大熊猫季节性分布的影响

大熊猫主要采食竹子,因此主食竹对大熊猫生存具有重要的作用。在秦岭的佛坪地区的大熊猫主要取食巴山木竹以及秦岭箭竹。本文研究了海拔对这两种竹林的结构与营养含量的影响以及海拔与大熊猫季节性分布的关系。结果表明：（1）海拔对竹林基径、株高有显著影响（p0.05）;整齐度、均匀度、基径和株高分布的偏度值和峰度值均随海拔变化而变化。（2）海拔对主食竹营养含量的显著影响随季节而变化（春季粗蛋白和总糖p=0.02;夏季粗纤维p=0.01;秋季粗蛋白p=0.04、粗纤维p=0.04和总糖p0.01）。每个竹种在叶、枝、杆三个部位间的营养均有显著性差异（p0.05）。（3）海拔对竹林结构及营养的显著影响决定了大熊猫对主食竹的取食策略,夏季在高海拔活动,其余季节在低海拔活动。本文的研究结果对理解海拔、主食竹结构、营养以及大熊猫迁移活动之间的关系有重要作用,为圈养大熊猫的饲料配比提供理论依据,也为野外大熊猫的保护和规范保护区内部的人类活动提供科学支撑。     

肿瘤精准免疫诊断综合评估

近年来,肿瘤免疫治疗(cancer immunotherapies)已成为晚期恶性肿瘤治疗的重要手段之一。肿瘤免疫治疗并不直接攻击癌细胞,而是通过调节人体自身免疫系统来抗击肿瘤,有望像抗生素改变抗感染治疗一样改变肿瘤治疗范式。抗PD-1/L1和抗CTLA-4抗体药物作为肿瘤免疫治疗的代表药物,使晚期癌症患者五年生存率达成了数倍的提升,被认为是真正有希望治愈癌症的治疗方式。然而,肿瘤免疫治疗只对部分患者有效,并且存在耐药、超进展、不良反应等问题。如何准确筛选出最有可能从治疗中获益的人群成为肿瘤免疫治疗研究中的一个重大挑战。目前有多个与免疫治疗相关的生物标志物正在研究中,并且有望被用于临床筛选治疗获益人群;但这些生物标记物也存在很多缺陷。未来,围绕免疫治疗敏感性和副反应的多项指标综合评估可能成为一个趋势。     

牛IFN-γ原核表达、单克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立

实验旨在建立牛重组IFN-γ(BovIFN-γ)的ELISA检测技术,为牛传染病的免疫学诊断提供新方法。PHA刺激体外培养的奶牛外周血白细胞,从培养细胞中提取总RNA,经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ基因cDNA,进一步克隆至pET28a,转化大肠杆菌,经IPTG诱导,表达出预期大小(18kD左右)组氨酸标记蛋白,经鉴定为BovIFN-γ;以纯化的重组BovIFN-γ为免疫原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得4株能稳定分泌抗BovIFN-γ单克隆抗体的细胞株,分别命名为A7、A10、G6与G10。免疫球蛋白亚类鉴定证明杂交瘤细胞所分泌的抗体均为IgG1,腹水效价在1∶210×100~1∶211×100之间。Western-blot分析显示,4株单抗均能特异性结合重组BovIFN-γ。ELISA试验表明,4株单抗只与融合蛋白BovIFN-γ反应,而不与非相关性蛋白Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF等发生反应。选取A10细胞株分泌的单克隆抗体、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,建立了检测BovIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。实验结果表明,此方法检测敏感性达到2ng/mL,特异性良好,为进一步建立灵敏、特异的病原感染诊断方法奠定了基础。     

生态资产评价方法研究——以青海省为例

生态资产是自然资源资产的重要组成部分,保护和恢复生态系统的目的就是增加生态资产,增强生态资产提供生态系统服务的能力。青海省生态资产丰富,生态区位重要,各级政府高度重视青海省的生态文明建设,评估青海省生态保护与恢复成效对于合理保护青海省生态资产具有重要意义。通过核算生态资产面积、质量,建立生态资产指数指标,综合评估了青海全省以及重点生态功能区和非重点生态功能区各类生态资产实物量现状和过去15年的变化。青海省生态资产以草地生态资产为主,同时拥有丰富的野生动植物资源。草地生态资产质量分布较为均匀,优良以上级别占草地总面积的32.1%;森林生态资产质量呈两极分化状态,灌丛生态资产质量较差,自然湿地生态资产质量整体较好。十五年间,青海省生态资产面积变化幅度不大,但是自然生态资产质量显著提升,生态资产指数稳步增长。全省自然生态资产面积增加3239.3 km2,其中自然湿地面积增加15.1%。全省优良质量以上自然生态资产面积增加61920.1 km~2,增幅高达55.5%;其中,重点生态功能区优良级别以上生态资产面积增加48621.9 km2,非重点生态功能区优良以上生态资产面积增加13298.3 km~2。青海省生态资产综合指数从240.37增长到278.22,提高了15.7%。退耕还林还草、湿地生态补偿、三江源自然保护区生态保护和建设工程、青海湖流域生态环境保护与综合治理工程等一系列生态保护与恢复工程对青海省自然生态资产面积增加和质量提升起到积极作用。青海省生态资产变化亦受气候因素影响,气候变化导致自然湿地生态资产面积增加、草地生态资产面积减少同时热量增加在一定程度上促进了森林、灌丛、草地生态资产质量的提升。     

生态资产核算及变化特征评估——以内蒙古兴安盟为例

生态资产是自然资源资产的重要组成部分,生态资产核算对完善自然资源负债表编制具有一定的意义。以兴安盟为例,通过对森林、灌丛、草地和湿地生态资产数量、质量和变化情况的评估,核算了兴安盟生态资产综合指数,即反映生态资产数量和质量的综合指标;编制了生态资产实物量变化表和生态资产实物量损益表。结果表明,2000—2010年,兴安盟森林面积增加1.1%,草地、湿地面积分别下降1.7%、3.8%,但森林和草地的质量提高显著,所以生态资产综合指数提高了2.16%。生态资产核算作为评价领导干部在任期间是否落实生态环境质量底线、生态保护红线要求的有效工具,为推动兴安盟生态文明建设提供一定的参考。     

AFLP标记及在植物中的应用

ＡＦＬＰ是 1 992年由荷兰Ｋｅｙｇｅｎｅ公司Ｚａｂｅａｕ、Ｖｏｓ在ＰＣＲ和ＲＦＬＰ的基础上发展起来的一种检测ＤＮＡ多态性的新方法[1] ,并于1 993年获得欧洲专利局专利。与ＲＦＬＰ类似 ,ＡＦＬＰ也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测ＤＮＡ多态性的一种ＤＮＡ分子标记技术。由于ＲＦＬＰ是以传统的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交为基础的 ,操作繁琐 ,对ＤＮＡ多态性的检出的灵敏度不高 ,在连锁图上有很多大的空间区。随着ＰＣＲ技术广泛应用 ,对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用。除了ＲＦＬＰ(限制性内切酶酶切片段长度多态性标记 …     

利用培养组学技术分离培养肺部微生物群研究

[目的]使用培养组学技术分离培养肺部微生物群,初步了解人体肺部可培养细菌的组成特点,建立呼吸道微生物菌库,为以后进行重点菌株的功能研究提供菌株条件.[方法]针对6个临床肺泡灌洗液样本,使用补充不同添加剂的血培养瓶对样本进行预增菌,在预增菌不同的时间点对血培养瓶内细菌进行分离培养和保藏,使用MALDI-TOF质谱和16S...