一种新的B链C端去四肽胰岛素的研制方法

报道了将单体胰岛素前体(MIP)经胰蛋白酶和羧肽酶B两步连续酶切获得B链C端去四肽胰岛素(DTI)的方法。MIP由甲醇酵母表达,最高发酵表达量达到150mg/L。发酵液中MIP通过疏水层析,分子筛初步纯化后直接进行酶切,在胰蛋白酶酶切3h后加入抑制剂paminobenzamidine处理15min,然后直接加入羧肽酶B酶切6h,再通过反相柱纯化即可得到纯品DTI,从分子筛到最后DTI,总纯化得率达到77%。按中国药典小白鼠惊厥法测定得DTI的生物活力为22IU/mg,是胰岛素的80%,在Superdex G-75分子筛上测定DTI的解离聚合曲线,证明其是单体。     

锌转运蛋白8在酿酒酵母中的重组表达及其抗原性分析北大核心CSCD

锌转运蛋白8(zinc transporter 8,ZnT8)是Ⅰ型糖尿病的重要候选抗原,基于ZnT8所开发的自身抗体检测试剂盒可用于帮助诊断Ⅰ型糖尿病,相关产品已在欧美国家上市。目前,国内正在积极开发Ⅰ型糖尿病检测试剂盒,由于国内尚未建立活性ZnT8的重组生产体系,因此这一关键原料严重依赖进口。本研究主要利用酿酒酵母系统开展了ZnT8的重组表达研究。首先,设计了ZnT8的多种抗原形式,分别为C端单倍体蛋白(C)、C端二倍体(C-C)以及N端和C端串联体蛋白(N-C),并使用酿酒酵母系统对上述蛋白进行了重组表达与纯化。随后,通过桥连法ELISA对纯化蛋白进行了抗原性测试,检测13位Ⅰ型糖尿病病人血清及16位健康志愿者血清后发现:C、N-C、C-C蛋白具有相似的检出率,分别为53.8%(7/13)、61.5%(8/13)及53.8%(7/13);3组的特异性均为100%(16/16);N-C蛋白相对其他2个蛋白而言,其在P3、P4、P8阳性样本上的检测值提高90%以上,表明具有更好的血清抗体识别能力。最后,选取N-C蛋白做进一步的血清样本测试,并将测试结果用ROC曲线进行敏感性及特异性表征,结果表明,与进口金标抗原相比,本方法敏感性无明显差异,特异性有待提高。综上可见,本研究基于酿酒酵母表达生产的ZnT8 N-C串联体蛋白有潜力作为Ⅰ型糖尿病体外诊断试剂开发中的国产替代原料。     

2016至2019年朱鹮野生种群收容救护现状分析

朱鹮(Nipponia nippon)野生种群目前仅分布在陕西省洋县及邻近的城固、西乡、南郑、汉台、勉县、宁强、留坝、汉阴等9个县区,数量达到2 500余只,但对其野外伤病和收容救治状况报道较少.陕西汉中朱鹮国家级自然保护区在2016至2019年的巡护和监测过程中,共发现并收容救治野生朱鹮伤病个体362只.本文利用双因...     

利用多基因缺失型杆状病毒在昆虫细胞中生产腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一,产量低、成本高是该产业面临的关键瓶颈问题。本研究旨在基于多基因缺失型杆状病毒,建立双病毒感染昆虫细胞以生产AAV的技术体系。首先,进行AAV生产用多基因缺失型重组杆状病毒的构建和扩增,并检测杆状病毒滴度及其感染细胞的效果;然后,使用双杆状病毒共感染昆虫细胞,并优化感染条件;最后,基于优化条件进行AAV生产,并检测评估产量、质量等相关指标。结果表明,AAV生产用多基因缺失型杆状病毒滴度较野生型无差异,感染后细胞存活率下降明显减缓。使用双病毒路线进行AAV优化生产,Bac4.0-1的基因组滴度为1.63×10¹¹ VG/mL,Bac5.0-2的基因组滴度为1.02×10¹¹ VG/mL,较野生型产量分别提升了240%和110%。电镜下,3组均具有正常的AAV病毒形态,且转导活性相近。本研究建立了基于多基因缺失型杆状病毒感染昆虫细胞的AAV生产体系,显著提高了AAV产量,具有一定的应用价值。     

庙岛群岛北五岛景观格局特征及其生态效应

海岛由于自然特征的空间差异、人类活动的日益增强以及生态系统的脆弱性,其景观格局空间分异性明显且生态效应趋于复杂。以庙岛群岛北五岛为研究区,基于现场调查和3S技术,从景观尺度、海岛尺度和区块尺度分析海岛景观格局空间特征,进而探讨景观格局与净初级生产力(NPP)、植物多样性和土壤性质的关系。结果显示:(1)不同尺度景观格局均表现出了空间差异。景观尺度上,针叶林、阔叶林和草地3类植被景观面积最大,斑块密度、边缘密度和平均形状指数总体较高,建筑用地也具有较大规模,其斑块密度较高,平均形状指数处于最低值,裸地也具有一定规模,其各项景观指标处于中间位置;海岛尺度上,随着海岛面积、人口和GDP的增加,斑块密度和人为干扰指数均明显增大;区块尺度上,斑块密度、边缘密度和平均形状指数与海拔呈显著正相关,人为干扰指数与海拔和坡度均呈显著负相关。海岛面积、地形和人类活动分别是北五岛景观格局的基本因子、重要限制因子和直接驱动因子。(2)海岛景观格局的生态效应与尺度密切相关。景观尺度上,各项生态效应指标在不同景观类型上均具有显著差异,海岛尺度上的生态效应指标对景观格局的响应不甚灵敏;区块尺度上,生态效应指标与景观格局指数表现出了显著的简单相关性和偏相关性,但二者结果具有差异。NPP和土壤水分主要受到景观类型和植被生长状况的影响,多样性和土壤养分同时受到景观类型和景观格局破碎度、边缘效应的影响,人为活动强度的增大地带来了各项生态效应指标的降低。控制建设规模、优化景观布局与改进开发利用方式是维系海岛生态系统稳定性的重要措施。     

干旱对夏玉米苗期叶片权衡生长的影响

叶片是植物对干旱响应最敏感的器官之一,叶片性状变化及其权衡关系能够反映植物对资源的利用策略以及对干旱的适应对策。基于2014年6个初始土壤水分梯度的夏玉米持续干旱模拟试验研究表明,随着干旱的发展,夏玉米各叶片性状均会受到影响,但不同干旱程度的影响不一致。基于水分胁迫系数及干旱持续时间提出了干旱程度的定量表达,随着干旱的发生发展,干旱程度在0—1之间变化。当干旱程度小于0.21时,夏玉米叶片性状不会受到显著影响;0.21—0.76时,叶片性状大小受到影响,但变化趋势不会发生改变;0.76—0.91时,新叶形成补偿不了老叶脱落,有效叶片数、叶干重、绿叶面积和叶含水量等性状提前出现下降趋势;大于0.91时,叶片生长几乎停滞。夏玉米叶片性状在干旱条件下的适应性生长本质上体现了其在快速生长与维持生存之间的权衡,但不同干旱程度下,夏玉米叶片性状生长的权衡策略不同:未发生干旱时,夏玉米倾向于维持较高的代谢活性,一旦干旱程度大于0,夏玉米就会降低叶片代谢活性;当干旱程度小于0.48时,夏玉米倾向于通过迅速增加叶面积来吸收较多的能量,以获得较大的生长速率,为生殖器官的生长及产量形成储备能量;当干旱程度大于0.48时,夏玉米会减小单叶面积以减少水分散失,倾向于资源贮存以提高其生存能力。     

应用流式细胞术检测毕赤酵母的细胞活性

选取两种细胞活性染色试剂二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate,FDA)和碘化丙锭(propidiumiodide,PI),应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测毕赤酵母细胞活性。比较FDA/PI双染色与PI单染色的FCM图谱,后者能够很好地将死活细胞区分开来并得到正确的比例。利用PI单染色检测发酵过程细胞活性的变化,甘油补料阶段几乎没有细胞死亡,进入甲醇补料阶段后,随着细胞密度的增加,细胞的活性不断降低,发酵88h时细胞活性仅为73.8%。     

氨基糖甙类抗生素JI-20A发酵培养条件的研究

研究了氨基糖甙类抗生素JI-20A分批发酵培养基和发酵工艺的优化。结果表明发酵培养基的优化组成为玉米淀粉60g/L,花生饼粉30g/L,麦芽糖10g/L,玉米浆8g/L,复合无机盐适量,淀粉酶适量,蛋氨酸1g/L和氯化钴6μg/mL。控制消后培养基pH值和氧的供应条件有助于抗生素JI-20A产生菌的菌体生长和产物合成。     

海洋真菌灰绿曲霉蓝光感应基因Agwc1的克隆、鉴定与序列分析

蓝光感应系统在不同的光感应过程中都起到十分关键的作用,这些生理过程包括无性/有性发育,昼夜节律钟,次级代谢产物的生成等.为了对蓝光感应系统作进一步的研究,通过简并引物PCR 和基因组走读方法得到了海洋真菌灰绿曲霉蓝光调节受体基因Agwc1,并通过多种生物信息学方法对其核苷酸和蛋白质序列进行了分析.Agwc1 基因全长2 724 bp,包含3个内含子,编码852 个氨基酸,蛋白质分子量是96 kD,等电点为8.17,很有可能定位于细胞核中,通过序列比对与系统进化树分析,发现AgWC1 蛋白与其他物种中的WC-1 蛋白有很高的同源性.在本研究中成功鉴定了Agwc1 基因,这是国际上首次在海洋丝状真菌领域鉴定光感应基因,并且AgWC1 很有可能在灰绿曲霉蓝光感应系统中发挥重要功能.     

重组CHO-GS细胞降低氨毒副作用的代谢研究

在重组CHOGS细胞无血清批培养过程中,由于GS系统的引入,使氨对细胞的毒副作用显著降低,从而引起细胞生长和代谢途径发生变化。当起始氨浓度为1.42mmolL时,细胞最高密度可达到15.6×105cellsmL,随着氨浓度的增加,尽管细胞生长受到一定的抑制,但在氨浓度为12.65mmolL时,细胞密度仍可达到8.9×105cellsmL。当起始氨浓度从0.36mmolL增加到12.65mmolL时,细胞对葡萄糖的得率系数和乳酸对葡萄糖的得率系数降低,己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)酶活分别提高了43%、140%和25%,表明细胞对葡萄糖的利用增加,糖代谢更倾向于高能量生成途径。在谷氨酰胺代谢途径中,氨促进了谷丙转氨酶(GPT)酶活,谷氨酸到α酮戊二酸的转化逐渐倾向于谷丙转氨途径,谷氨酸脱氢酶(GDH)酶活降低,脱氨途径相应受到抑制。此外,氨浓度的增加使细胞群体处于G0G1期的比例逐渐升高,当氨浓度为12.65mmolL时,重组蛋白比生产速率比氨浓度为0.36mmolL时提高了2.1倍。