溶藻弧菌HY9901 ahr基因克隆与序列分析

TouchdownPCR扩增溶藻弧菌依赖ATP的DNA解旋酶rep基因部分序列,得一1．2kb片段,再以反向PCR和巢式PCR联合扩增其侧翼序列,拼接得一由2016bp组成,共编码671aa的完整基因。该基因演绎的氨基酸序列与几种弧菌的同源性都比较高,与副溶血弧菌RIMD2210633、溶藻弧菌12G01、Vibriosp．Ex25、创伤弧菌YJ016、霍乱弧菌RC385、灿烂弧菌12801、费氏弧菌ES114及矿angustumS14分别为96％、95%、95%、94%、92％、91%、89％、86％。     

玛珥湖好氧不产氧光合细菌pufM基因DNA和mRNA的定量及多样性分析

【目的】湖光岩玛珥湖是一类特殊的火山口湖,它完全封闭,地质年代久远,尚未受人类活动的剧烈影响,孕育着丰富而特殊的微生物种群。好氧不产氧光合细菌(AAPB)是以其在有氧情况下能行使光合功能而定义的一类专性异养细菌,其生理生态特征独特,进化年代久远,在水生生态系统的上层水体中广泛分布。目前,AAPB在玛珥湖水体中是否有分布仍是未知。【方法】构建和比较夏季湖水1 m、5 m、12 m三个水层的总DNA和总RNA的AAPB光合中心合成的关键基因pufM的6个克隆文库,并结合定量PCR技术,分析了不同水层AAPB的分布、系统发育多样性及其在总细菌中的比重。【结果】6个文库覆盖率和稀释曲线显示样本初步揭示了各水层优势AAPB类群的多样性。BLAST核苷酸同源性介于80%93%;多样性指数表明,湖光岩表层和底层多样性相当,中间层最低,总RNA的多样性高于总DNA。系统发育分析结果表明,OTU21 24所含的序列(占总序列的49.43%)与β-变形细菌的进化距离最接近,是湖光岩玛珥湖的优势AAPB菌群。定量PCR结果显示1 m水层中AAPB在总细菌中的比重最高,可达38.06%;而5 m水层中AAPB所占的比重最低,仅为0.85%;12 m为9.54%。【结论】湖光岩玛珥湖孕育着丰富而多样的AAPB类群。     

淡水鱼类粘孢子虫的18S rDNA分子系统学研究

利用两个通用引物myxoF(5‘-CGCGGTAATTCCAGCTCCAGTAG-3‘)和myxoR(5-ACCAGGTAAGTTTTCCGTGTTGA-3’)成功扩增出圆形碘泡虫、全圆碘泡虫、武汉单极虫、微山尾孢虫和库班碘泡虫5种粘孢子虫的部分18S rDNA序列,其GenBank登录号为：AY165179-AY165183。并结合GenBank其他13个相关序列构建了18个物种的分子系统树。结果表明,碘泡虫,尾孢虫和单极虫较Tetracapsula bryozoides和“PKX”分化晚,它们形成了2个聚类：T．wuhanensis-T.hovorkai-M.rotundatus-M.rotundus-M.bidullatus-M.pellicides-M.pendula-H.salminicola聚类和H.exilis-H.ictaluri-M.spinacurvatura-M.osburni-H.lesteri-H.weishanensis-M.kubanicum的聚类;同一属内,采自国内的种类并没有因为地域关系而形成独立的分支,而是与国外的种类交叉在一起,这意味着粘孢子虫种类之间的地域差别并不大;碘泡虫和尾孢虫在进化上都不是单系的,而且分子数据难以将这两个属的种类分开,因此尾孢虫的尾突可能并不是有效的分类依据,而是和碘泡虫的壳片突起同源的一种附属结构。     

β-葡聚糖刺激下的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)转录组分析

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)是一种重要的海水经济养殖鱼类,然而病害是制约其养殖产量的一个重要因素。近年来-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂在水产养殖业中得到广泛应用。本研究采用腹腔注射0.2 mL-葡聚糖(浓度0.05 g/mL)刺激斜带石斑鱼,在刺激6 h、72 h后分别取头肾、血液淋巴细胞、胸腺和脾脏组织进行转录测序。结果一共组装了175 568条unigene,平均长度是1 507 bp。通过Blast比对数据库进行功能注释,一共注释了121 629条unigene。六大数据库注释得到的unigene数量分别为:91 955条(Nt)、66 089条(Nr)、14 126条(GO)、24 018条(COG)、9 673条(KEGG)和54 148条(Swiss Prot)。根据基因差异表达分析筛选出6类免疫相关的显著性差异基因71个,涉及抗原加工呈递、细胞粘附分子、补体系统、细胞因子、模式识别受体和吞噬作用。对差异基因进行GO富集分析,筛选出免疫相关条目7条,包括免疫应答、B细胞受体信号通路、趋化因子受体活性、白细胞趋化性、趋化因子调节信号通路、白细胞介素-1受体绑定和溶酶体组份。随机挑选7个显著性差异的免疫基因进行qRT-PCR验证,验证结果与测序结果变化趋势一致。本实验结果为研究-葡聚糖调节鱼类免疫系统的作用机制提供数据参考。     

粘孢子虫免疫学研究进展

粘孢子虫(Myxosporean)除少数种类寄生在蠕虫、两栖类和爬行类外1,绝大部分寄生于鱼类(包括海水鱼类和淡水鱼类),可以说粘孢子虫是鱼类特有的一类寄生原生动物       

温度对溶藻弧菌HY9901株致病性相关蛋白的调控

将溶藻弧菌HY9901株置于15℃、20℃、28℃、37℃四个温度下培养,18h时分别测定细菌含量,胞外蛋白酶（Extracelluar protease, ECPase）表达量以及胞外产物（Extracellular product, ECP）对动物的致死性。结果表明,随着温度升高, 菌液浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率先升高后下降。28℃培养的细菌浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率均为最大。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析不同温度培养下细菌的ECP和外膜蛋白(Outer membrane protein, OMP),结果显示,不同温度培养的溶藻弧菌ECP和OMP电泳图谱不同。溶藻弧菌主要ECP的分子量为70kD和62kD。ECP 70kD在20℃时的表达量最大,而28℃时ECP 62 kD的蛋白浓度最高。45kD OMP随着温度升高,其合成量增大,28℃时达最大值;而40kD和34kD OMP则随着温度的升高而减弱。通过研究电泳纯化的ECP 62kD和ECP 70kD的酶活性和致死试验,证明ECP 62kD具有很强的酶活性和毒性, 而ECP 70kD仅具有弱的酶活性和毒性。     

甘草对大鲵抗嗜水气单胞菌感染的作用

通过投喂甘草提取物, 研究了甘草对大鲵(Andrias davidianus)抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的作用。连续投喂56d, 从28d开始, 药物组血清溶菌酶活性先升后降, 呈抛物线趋势, 低剂量组在42d出现最大值(158.4±34.7) U/mL, 高剂量组在35d出现最大值(178.3±28.8) U/mL, 两者都显著高于同期对照组(P<0.05)。药物组在最后两次采样期, 即42d和56d时, 肾脏巨噬细胞吞噬活性显著高于对照组(P<0.05)。低剂量组和高剂量组最大值均出现在42d, 分别为(59.4±8.5)%和(58.4±5.2)%。同期相比, 药物组白细胞比容值均高于对照组。其中, 高剂量组在28d时白细胞比容值为(5.8±1.7)%, 低剂量组在56d时为(5.5±0.8)%, 高剂量组在56d时为(5.9±1.7)%, 三者都显著高于同期对照组(P<0.05)。药物组和对照组的脾脏脏器系数之间没有显示出显著差异。最后一次采样(56d)后人工感染嗜水气单胞菌, 对照组死亡率为90%, 低剂量组和高剂量组都为60%, 均低于对照组, 而药物组免疫保护率为33.3%, 也都高于对照组。结果表明, 投喂甘草提取物可在一定程度上提高大鲵对嗜水气单胞菌的抗性。     

湖光岩玛珥湖可培养浮游细菌的BOX-PCR图谱及生物多样性分析

玛珥湖是一类具有独特地质构造特征的火山口湖泊, 目前国内外对玛珥湖内微生物多样性的研究还鲜有报道。为了解具有典型玛珥特征的湖光岩湖泊中可培养浮游细菌的种群资源特征, 采用盒式PCR (BOX-PCR) 筛选技术, 通过通用贫营养和原位湖水培养基研究在冬夏两季各水层内获得的可培养细菌种群的差异。结果表明: 不同培养基在不同水层上表现的细菌数量的变化相一致, 为夏季的5 m>1 m>13 m, 冬季的1 m>5 m>13 m, 变形菌占据优势地位, 其它为放线菌、厚壁菌和拟杆菌; 两类培养基上所获培养菌BOX-PCR图谱的多样性相似, 但菌群结构不同; 而细菌多样性在季节上的变化表现为冬季高于夏季, 这与相关湖泊内细菌微生物多样性在夏季会发生减少的特点相似; 相同季节同一水层上不同培养基上获得的培养菌门类不同, 表明此类通用性培养基在培养该环境微生物中的局限。研究的结果为探讨此类型湖泊微生物多样性与环境的关系及分离该环境下特定微生物菌株提供参考。     

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)NCCRP-1在多种组织中表达的免疫组化研究

非特异性细胞毒性细胞(non-specific cytotoxic cell,NCC)是硬骨鱼中一类淋巴细胞,在非特异性免疫中通过上调炎症反应释放细胞因子发挥重要的作用,是哺乳动物中NK细胞的等价物。鱼类NCC在体内多个组织器官中均有分布,其细胞毒性是自发的,可杀死多种靶细胞,例如同种异源或异种异源肿瘤细胞,寄生性原生动物和被病原侵染的细胞。NCCRP-1是NCC上的一种标志性受体。本研究对尼罗罗非鱼的脑,头肾,肝脏和脾脏进行切片,对NCCRP-1进行染色,通过免疫组化分析得知NCC在这些组织中的分布情况。另外采用Percoll非连续密度梯度法分离纯化得到头肾NCC,采用免疫组化染色和FITC标签标记,与组织中的染色结果分布相同。相较于qPCR等技术,本研究更直观地观察NCC在组织中的分布特点,为深入研究NCC的功能奠定了基础。