水牛、大额牛和牦牛抑制素α亚基编码基因外显子1多态性分析

为了揭示牛科物种INHA基因的遗传特征,该文采用PCR产物直接测序法对水牛、大额牛和牦牛INHA基因外显子1及其侧翼序列进行多态性检测,并结合已发表的包括牛科物种在内的一些哺乳动物数据进行了比较分析。结果表明,在水牛INHA基因外显子1中存在c.73C>A替换,为同义替换,河流型和沼泽型水牛编码产物一致;在大额牛的INHA基因外显子1中发现c.62C>T、c.187G>A替换,分别引起INHA中氨基酸发生p.P21L、p.V63M改变,两者均为相同性质氨基酸的替换;在牦牛中发现c.62C>T、c.129A>G替换,前者也引起编码氨基酸发生p.P21L替换,后者为同义替换。在INHA基因5’侧翼区所测出的序列中,水牛、大额牛和牦牛等物种内均未发现SNP位点,但在种间发现存在c.-6T>G的替换,大额牛、牦牛和普通牛均为c.-6G,而水牛为c.-6T。在INHA基因内含子中,水牛的第31～36位核苷酸处发现有6个碱基的缺失,即c.262+31₂62+36delTCTGAC;该位点在河流型水牛中野生型（+/+）占主体,而在沼泽型水牛中则缺失型（-/-）占主体。在大额牛、牦牛和普通牛等其它牛科物种的内含子中均未发现该缺失,但与水牛相比,大额牛、牦牛和普通牛内含子中发现缺失c.262+78₂62+79delTG。序列比对显示,INHA基因外显子1序列中c.43A和c.67G为水牛中所特有,而c.173A和c.255G为大额牛、牦牛和普通牛所共有,c.24C、c.47G、c.174T和c.206T为山羊所特有。大额牛、牦牛和普通牛间INHA基因外显子1序列差异较小,而山羊和水牛与它们间的差异相对较大。     

白细胞介素—2—绿脓杆菌外毒素融合蛋白的分高纯化及其复性研究

表达的白细胞介素－２－绿脓杆菌外毒素（ＩＬ－２－ＰＥ）融合蛋白以包含体形式存在于宿主菌中,为分离纯化表达产物提供了方便,但因需进行复性,也增加了后处理的难度．我们采用４ｍｏｌ／Ｌ尿素、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的１×ＰＢＳ洗涤包含体两遍,再经ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００分子筛及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阴离子交换柱层析后,获得的融合蛋白纯度可达９０％～９５％。此外,我们从ＧＳＳＧ浓度、Ｌ－精氨酸浓度、复性蛋白质的起始浓度、复性液的ｐＨ值、复性温度及复性时间等参数入手,系统地研究了融合蛋白的复性条件,探索到了ＩＬ－２－ＭＥ４０和ＩＬ－２－ＰＥ６６４Ｇｌｕ融合蛋白复性的最适条件。     

菊粉酶产生菌的筛选及60Co诱变选育简

目的：从新疆石河子盐碱地菊芋生长根际土壤中分离筛选高产菊粉酶活力菌株。方法：通过稀释平板涂布法分离微生物;利用^60Co诱变选育,96孔板筛选突变菌株;采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定菊粉酶酶活。结果：分离到12株具有菊粉酶活力的菌株,复筛得到1株高产菊粉酶活力菌株,将其命名为G-60;以此菌株为出发菌株进行^60Co诱变,利用96孔板对诱变菌株进行筛选,经摇瓶发酵酶活测定,得到1株高产菊粉酶酶活的突变株,酶活达46．62U/mL,是未诱变菌株酶活的2．72倍。结论：经诱变得到1株高产菊粉酶活力的突变菌株。     

枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达

借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析。结果显示该脂肪酶基因全长635bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBIGenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性。将该基因克隆到pET-28a(+)表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达。SDS-PAGE电泳显示分泌表达的脂肪酶分子质量约为21kD。对表达条件优化后,在30℃、大肠杆菌菌液OD600值为1.8、乳糖诱导浓度为1.5mM、摇瓶发酵10h后大肠杆菌分泌表达26.0U/mL重组脂肪酶,相比较IPTG的诱导,既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白优势线性B细胞抗原决定簇的预测与确定

为了确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核衣壳蛋白(N蛋白)的优势线性B细胞抗原决定簇位点,本文根据线性B细胞抗原表位拥有较强的抗原性、亲水性以及表面性等特点,运用生物信息学软件分析SFTSV N蛋白的氨基酸序列,预测潜在的线性B细胞抗原决定簇位点。根据已解析的SFTSV N蛋白晶体结构,使用PyMOL软件分析预测出的线性B细胞抗原决定簇位点的柔性及其在整个SFTSV N蛋白中的分布情况。人工合成相应多肽片段并以其为抗原,与SFTSV临床感染者的血清反应,采用多肽-酶联免疫吸附检测法检验多肽片段的免疫原性。结果共预测出六个可能的线性B细胞抗原决定簇位点,即A(40-KKLKETGGDDWVKDTK-55)、B(71-ASGKMSNSGSKRL-83)、C(94-ERAETRL-100)、D(135-LKVENYPP-142)、E(157-GVSEATT-163)和F(184-KMRGASKTEVYNSFRDP-200),均位于N蛋白表面且含有柔性较大的loop区。相应的六段人工合成多肽都与SFTSV临床病例血清呈阳性反应,确定它们均为优势线性B细胞抗原决定簇位点,其各自检测结果与商品化N蛋白抗体检测试剂盒相应检测结果进行线性回归分析表明呈正相关。综合运用上述多种方法,本研究成功地预测并确定了SFTSV N蛋白的线性B细胞抗原决定簇位点,为该病毒抗原特异性的分子基础研究以及相关疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

重庆大巴山国家级自然保护区苔藓植物多样性

大巴山国家级自然保护区是我国35个生物多样性优先保护区域之一, 但苔藓植物的相关研究仍是空白。本文在详细的野外调查基础上, 记录该保护区苔藓植物57科141属390种, 其中苔类21科31属82种, 藓类36科110属308种, 新增重庆市苔藓植物新记录80种。物种多样性最丰富的科(种数≥ 10种)分别是青藓科、丛藓科、灰藓科、真藓科、提灯藓科和曲尾藓科, 共占总种数的41.03%。物种多样性最丰富的属(种数≥ 10种)分别是青藓属(Brachythecium)、真藓属(Bryum)、绢藓属(Entodon)、光萼苔属(Porella)和耳叶苔属(Frullania), 共占总种数的15.64%。在海拔1,000-2,480 m之间, 苔藓植物的物种多样性呈现随海拔升高先增加后减少的趋势, 其中, 在海拔1,200-1,600 m段物种最为丰富, 建议将这一地带进行优先保护。     

内皮细胞E—选择蛋白的表达及p53基因的影响

为探讨血管内皮细胞Ｅ－选择蛋白的表达及野生型ｐ５３基因对其表达的影响,采用流式细胞术及ＲＴ－ＰＣＲ法分别测定其Ｅ－选择蛋白及其ｍＲＮＡ水平。结果表明：静息状态的内皮细胞表面检测不到Ｅ－选择蛋白的表达,尽管此时细胞内存在Ｅ－选择蛋白的ｍＲＮＡ。肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）可浓度依赖性地诱导内皮细胞表达Ｅ－选择蛋白,内皮细胞表面Ｅ－选择蛋白表达的增加伴随着细胞内Ｅ－选择蛋白ｍＲＮＡ水平的升高。ＴＮＦα刺     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~rTc~s lac~ 转化体,得到另一个lac重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac的表达作了分析。     

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与鉴定

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子优化设计合成了HCoV-NL63的RBD大片段(RL:232-684aa)与小片段(RS:476-616aa)的编码基因,并将其克隆进硫氧还蛋白表达载体pM48,构建了人冠状病毒NL63的受体结合区蛋白(RBD)大(RL)、小(RS)片段与硫氧还蛋白的融合表达质粒;转化E.coli BL21pLys S,利用IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析对蛋白进行纯化,并以表达HCoV-NL63RL与RS蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠血清对重组蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明在37℃,0.8mM IPTG诱导4h时,蛋白表达量达到最高,融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后纯度可达95%以上。Western blot显示,两个融合蛋白均与痘苗病毒(天坛株)表达的HCoV-NL63RL与RS蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应。本研究首次在国内用原核系统表达纯化并鉴定了人冠状病毒NL63受体结合区大小蛋白(RL和RS),为人冠状病毒NL63感染的免疫学检测与疫苗研究提供了基础。