提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量

IncreasingSpecifityandYieldofPCRAmplificatingLongDNAFragmentLuYifan;DengJixian;XiaoChengzhu;MaQingjun(InstituteofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071)聚合酶链式反应（PCR）技术虽仅产生数年,却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域。它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段,用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面．目觎PCR扩增DNA片段长度可达到近50kb。这在生…     

非O-1群霍乱弧菌的鉴别诊断

本文对我院从急性腹泻患者分离的N-1菌株进行了一系列鉴定。实验结果表明:该菌用LT编码的基因分子探针测定无产CT基因,亦无LT和ST。但菌体确有毒力,致病性较强。电镜观察到该菌体表面有粘液层,并新发现有纤毛。N-1菌生化和生物学特性极似O-1群霍乱弧菌,但血清学否定了。气相色谱等试验证实为罕见的非O-1群霍乱弧菌。     

U2AF65蛋白表达水平影响基因UBQLN1的可变剪接

目的:研究U2AF65蛋白的表达水平对基因UBQLN1可变剪接的影响。方法:应用pSR-GFP/Neo载体构建2个U2AF65-siRNA干扰载体,转染293T细胞,通过Western印迹、QRT-PCR检测干扰效果,RT-PCR验证基因UBQLN1的可变剪接。结果:利用设计的U2AF65-siRNA能够干扰细胞中U2AF65的表达;RT-PCR结果显示U2AF65表达水平的下降促使UBQLN1第8外显子的跳跃增加。结论:U2AF65可以通过表达水平的变化参与调控基因UBQLN1的可变剪接。     

糖多孢红霉菌A226 的原生质体转化和染色体同源整合

糖多孢红霉菌的原生质体转化和染色体同源整合,是红霉素生物合成基因改造的重要途径。本研究对糖多孢红霉菌A226原生质体制备和转化条件进行了优化,结果表明以对数生长后期和稳定期菌丝体制备的原生质体转化效率较高;质粒、原生质体和PEG－T缓冲液体积比例为15：40：200（μl)时转化效果较好;比重小原生本的转化效率虽高,但在转化子中有效整合的比例较低;PEG1000和PEG3350对转化效率没有显差异;而Yamamoto转化系统优于Weber转化系统。PCR鉴定、抑菌活性鉴定和质谱分析均表明,转化质粒已整合到染色体红霉素合成基因位点。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白抑制胞质分裂和细胞增值

目的:SARS冠状病毒(SARS-CoV)的核衣壳蛋白(N蛋白)能够结合病毒RNA形成螺旋状的核衣壳。在3种不同的细胞系中分别表达SARS-CoVN蛋白,研究它对转染细胞生长的影响。方法:将重组质粒pEGFP-N和pEGFP(作为对照)分别转染人胚肾HEK293细胞、成纤维细胞3T3、人宫颈癌HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜、荧光显微镜观察SARS-CoVN蛋白在细胞内的定位以及细胞的生长变化。结果:SARS-CoVN蛋白能定位于细胞质,并不像其他冠状病毒N蛋白那样能够定位到细胞核。同时发现SARS-CoVN蛋白能够诱导形成多核细胞,多核细胞的百分率可达33.9%。结论:SARS-CoVN蛋白抑制胞质分裂,延缓细胞生长。     

CTB与HCV抗原决定簇融合蛋白的抗原性及其在抗HCV ELISA试剂盒中的应用

系统研究了通过霍乱毒素B亚基与HCV的4个抗原决定簇进行基因融合所表达的12种融合蛋白中HCV抗原决定簇的反应原性,探索了以融合蛋白为抗原,进行抗-HCV检测的途径。结果表明,多数融合蛋白中HCV抗原决定簇均能与对应的HCV抗体结合。以融合蛋白95082为抗原研制的抗-HCV ELISA试剂检测122名献血员血清,结果与美国雅培公司抗-HCV ELISA试剂检测的结果完全一致,经药品生物制品检定所检定,其特异性、灵敏度、精密性及稳定性均达到国家卫生部抗-HCV ELISA试剂的暂行检定标准。     

生物制药的现状和未来(一):历史与现实市场

以基因工程产品、抗体工程产品和细胞工程产品为主要代表的生物制药产业是发展最快的高技术产业之一 ,最近 6年全球年销售额连续每年以 1 5 %～ 33%的速度增长 ,并在 2 0 0 4年突破 40 0亿美元。生物技术药物在治疗肾性贫血、白细胞减少、癌症、器官移植排斥、类风湿关节炎、糖尿病、矮小症、心肌梗死、乙肝、丙肝、多发性硬皮病、不孕症、粘多糖病、戈谢病、法布莱氏病、囊性纤维化、血友病、银屑病和脓毒症等发挥了重要乃至关键作用。综述生物制药的历史、现状和市场。     

从小牛胸腺分离纯化末端脱氧核苷酸转移酶

本文采用Okamura氏的寡聚脱氧胸苷酸(oligo-dT)-纤维素柱层析法分离纯化小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。包括下列主要步骤:制备酶粗提液、磷酸纤维素柱层析、二乙基氨基乙基纤维素柱层析、葡聚糖凝胶过滤、oligo dT-纤维素亲和层析。经过上述几步分离纯化,从500克小牛胸腺中获得6,564单位TdT,比活性达5,199单位/毫克蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳呈一条带,不含脱氧核糖核酸(DNA)多聚酶Ⅰ。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的研究进展

核衣壳蛋白(N蛋白)是SARS冠状病毒(SARS-CoV)的结构蛋白,与病毒RNA结合形成核衣壳,是主要的抗原分子。最近的亚定位研究表明,它主要定位到细胞质,核仁内也有较少的分布。SARS-CoVN蛋白参与SARS-CoVRNA合成的调控以及核衣壳的形成,并能结合人亲环素(hCypA)解离病毒核心,激活AP-1信号转导途径,类泛素蛋白化干扰宿主细胞分裂,在缺乏生长因子的情况下诱导细胞凋亡。     

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA的克隆和序列测定

用Ficoll-Paque从正常中国人外周血中分离单个核细胞,在RPMI 1640培养基(含10％小牛血清,2mrnol/L谷氨酰胺)中培养2小时,洗涤去除未贴壁细胞,将贴壁单核细胞用含10μg/mLLPS的培养基继续培养2小时。用异硫氰酸胍-酸酚法提取LPS诱导后的单核细胞总RNA,从中取1μg.总RNA作模板,以oli-go(dt)_(15)为引物,使用Promega公司AMV逆转录酶