利用PCR方法从人染色体DNA中扩增G-CSF基因

利用PCR技术从染色体基因组DNA中扩增大DNA片段具有相当大的难度。本试验采用碱变性模板以及热启动等方法,成功地扩增出1.5kb的人基因组DNA,并讨论了影响扩增大DNA片段特异性和产量的因素。     

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。     

疟疾疫苗

疟疾是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一,世界上有20亿人口生活在疫区,每年全球大约有5亿人口患病,其中50％是由恶性疟原虫引起的每年死于疟疾的人口约100万－300万,尽管疟原虫的生物学研究仍不甚明晰,疟疾疫苗的研究在最近的30年中仍取得了明显的成果,针对疟原虫的生活各周期的主要保护性抗原,科研人员已研制了一系列的疟疾侯选疫苗,如CSP疟疾疫苗,MSP1疟疾疫苗,pfs25疟疾疫苗和SPf66多期多抗原合成疟疾疫苗等。目前疟疾疫苗主要历经减毒疫苗,亚单位疫苗和DNA疫苗三种形式,因为在疟原虫生活周期不同阶段存在着不同的候选抗原,依此又可将疟疾候选疫苗按其起作用时期分为红细胞前期疫苗,红细胞内期疫苗,配子期疫苗和多期多抗原疫苗,但到目前为止,仍未开发出十分理想的疟疾疫苗,由于疟原虫生活史复杂,抗原多且免疫原性弱,单独应用疟疾疫苗难以取得很好的预防效果,所以必须配合以佐剂来增强其免疫效果,然而不同的佐剂对不同疟疾候选疫苗的免疫增强效果有着明显差异,因此佐剂的选择是疫苗成功与否的关键因素之一,另外,宿主的遗传性限制也影响着疫苗的保护效果。     

pcD-awte候选疟疾DNA疫苗制备及其质量相关性分析

本实验室构建的疟疾DNA疫苗经动物试验表明具有很好的免疫原性,为申请临床试验,进行了制备工艺的研究。本研究将含pcD-awte质粒的大肠杆菌DH5α在发酵罐中发酵培养,碱裂解法粗提质粒,再依次通过Sepharose 6FF分子筛层析、Plasmidselect 亲硫吸附层析和Source 30Q离子交换层析精制获得质粒纯品,并对纯品进行质量分析。结果每升培养液可获得质粒纯品43.9mg,质量符合Ferreira等推荐的药用标准。     

B淋巴细胞激活因子研究进展

B淋巴细胞刺激因子(BAFF)在B细胞免疫中具有促进B细胞的分化、成熟,调节体液中的抗体反应等重要的作用。然而过多的BANFF表达可使B细胞存活时间延长,B细胞数目增多,活性过高而导致自身免疫性疾病。BAFF与细胞表面的三种受体结合,执行着并不完全相同的功能。由于BAFF在B细胞发育、分化及白体免疫性疾病(特别是系统性红斑狼疮)中具有重要的作用,BAFF及其下游的信号转导因子成为疾病治疗的理想靶位。     

人内皮抑素基因的克隆以及在大肠杆菌中的可溶性表达研究

用PCR的方法从人胎肝cDNA文库中得到人内皮抑素基因 ,克隆测序正确后连接到硫氧还蛋白融合表达载体上 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)得到表达人内皮抑素的工程菌。用IPTG诱导表达 ,表达量达到全菌蛋白的 64%。经分析硫氧还蛋白可以辅助内皮抑素可溶性表达 ,表达的融合蛋白保持了天然蛋白的免疫学特性。而且表面带有多聚组氨酸的突变的硫氧还蛋白还简化了蛋白纯化的步骤 ,使融合蛋白可以通过固相金属螯和层析 (IMAC)的方法纯化。纯化后的融合蛋白经IgA蛋白酶的切割可得到大小正确的重组人内皮抑素 ,用此方法获得的重组人内皮抑素可以在CAM试验中抑制新生血管的形成。高效可溶型表达内皮抑素的工程菌的构建成功 ,为内皮抑素的生产应用打下了良好的基础。     

超抗原抗癌药物研究进展

肿瘤患的免疫系统通常处于免疫抑制状态,因此如何增强激活机体免疫系统是肿瘤生物治疗关注的问题。超抗原是目前所知的最强的分裂原,极微量的超抗原便能激活大量的T细胞,能对MHC-Ⅱ 肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用,因而超抗原的抗癌应用颇受重视。本对超抗原抗肿瘤的研究状况及存在问题作了简要回顾。     

恶性疟原虫多抗原表位基因的融合与表达

本研究以霍乱毒素B亚基(CT-B)基因为载体,构建了含不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因CTB/ATE和CTB/AWTE。前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因SPf66外,还含有很强的T辅助细胞表位CST3和Tc细胞表位;后者在此基础上将我国发现的B细胞表位NKNDD基因经8次串联后融合其中、两种形式的融合基因经测序正确后转入大肠杆菌TK1046中,产量分别为10mg/L及5mg/L。表达产物CTB/AWTE经亲和层析纯化的双抗夹心ELISA测定表明,该融合蛋白在保留了与抗CTB抗体结合的同时,与抗NKNDD单抗的结合效价达1∶8000。     

phoA基因的克隆和一种原核分泌表达筛选载体的构建

外源基因在原核细胞中的表达,是基因工程和分子生物学许多研究领域中应用最为广泛的技术,大肠杆菌已成为蛋白质表达的首选宿主和生产基因工程多肽药物的主要表达系统。发展通用的高表达、可溶性以及分泌性表达策略,是目前该领域研究中的重点发展方向。实现外源基因在大肠杆菌中的分泌表达,由于对蛋白质分泌机制的基础研究还不够深入,缺乏有力的理论指导,目前还存在许多问题,急需要发展新的研究技术和思路。研究表明,表达蛋白的性质是决定它能否有效分泌的重要性质,蛋白质中少数氨基酸的改变可显著的影响其分泌情况。为了能够方便的…     

病毒感染与宿主细胞DNA损伤应答

病毒感染宿主细胞后,利用细胞内的营养物质和原料进行复制和增殖,同时能引起宿主细胞启动抗病毒免疫应答的防御机制。此外,近年来的研究还表明病毒感染能够引起宿主细胞的DNA损伤应答,该反应是细胞另一种防止病毒入侵的自我保护机制。同时发现,病毒在长期进化过程中形成了不同的机制来对抗宿主细胞的DNA损伤应答,从而消除细胞对其复制和繁殖产生的不利影响。因此,研究和阐述病毒感染后引起宿主细胞DNA损伤应答途径的机制,可使我们采取相应对策选择新的抗病毒靶点,从而有利于新型抗病毒药物的开发。