利用甲基化特异性引物高通量检测DNA甲基化

建立一种基于甲基化特异性引物和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测新方法（MSP-SAGE）,首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的C转变为U,而甲基化的CpG不变.将处理和未处理的DNA双链变性后用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;将差异延伸的单链序列和频次信息经过系列分子操作后,引入PCR扩增模板;对中间带有未知序列的PCR扩增产物进行串连克隆测序.将来自于未处理组和处理组的某一CpG位点的序列出现的次数定义为［Tags］A和［Tags］B,将标准系列的实际甲基化水平和［Tags］B/［Tags］A之间建立线性回归方程.根据每一CpG位点的［Tags］B/［Tags］A比值可反推该位点的甲基化水平.MSP-SAGE具有良好的线性,基于标准系列的［Tags］B/［Tags］A与其实际甲基化水平的标准曲线方程为y＝1.455x（R²＝0.984,P<0.01）.MSP-SAGE的回收率在95%到110%之间,精确度位于4.2％和10.5%,检测限在3％左右,单次检测通量可达24个CpG位点.MSP-SAGE是一种很有应用前途的高通量DNA甲基化定量检测方法.     

人hIL-24Δ103重组腺病毒感染诱导A549细胞凋亡

白细胞介素24（interleukin 24,IL-24）是近年来新发现的1个IL-10家族细胞因子,具有明显的抗肿瘤活性．为了研究开发高活性、低分子量的IL-24,并探讨其用于肿瘤靶向治疗的可能性,本研究在前期基础上,进一步构建并制备了缺失N端103个氨基酸残基的IL-24（hIL-24Δ103）重组腺病毒,并观察了其对A549细胞生长增殖和凋亡的影响．首先,采用PCR技术扩增IL-24第104位至第206位氨基酸区域的编码序列,制备hIL-24Δ103重组腺病毒．用Ad-hIL-24Δ103重组腺病毒感染肺癌A549细胞. MTT分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染显著抑制了A549细胞的生长．Hoechst 33258染色和流式细胞仪分析结果表明,Ad-hIL 24Δ103感染导致细胞凋亡．Western 印迹分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染导致了PKR和eIF-2α蛋白的表达上调与磷酸化激活,提示PKR和eIF-2α参与了hIL-24Δ103导致的细胞生长抑制和细胞凋亡过程的调节．关键词 人白介素24;腺病毒;细胞增殖;细胞凋亡     

复杂疾病关联研究中的若干问题

关联研究广泛应用于阐述心血管疾病、2型糖尿病、原发性高血压和肥胖等人类复杂疾病的遗传学基础。文中就关联研究中混杂的识别与控制、候选基因的选择、中间表型的应用、单体型分析方法的应用,以及结果的判定等问题进行了讨论。人群分层是关联研究混杂的主要来源之一。选择患者亲属做对照、基因组对照和选择遗传背景较为一致的隔离人群都可以减少混杂。候选基因的选择可以基于与疾病间的生物学联系或是该基因与疾病某已知相关基因的同源性。适当的应用中间表型和单体型分析方法可以增加关联研究有意义发现的机会。本文认为,优化研究设计、足够的样本含量、正确选择对照,结合先进的数据分析方法,关联研究必将为困扰人类的常见疾病的易感性研究发挥更大的作用。     

上海市近地面CO2浓度及其与下垫面特征的定量关系

城市化所带来的土地利用变化和化石燃料燃烧对全球碳循环和气候变化产生了深远影响.明确城市区域CO₂浓度的空间变化特征,对于认识和控制温室气体排放、减少人类活动对全球气候变化的影响具有重要意义.本研究以高强度人类扰动和快速城市化背景下的上海市为研究对象,于2014年春季利用近红外气体分析仪Li 840A开展近地面CO2浓度样带监测,结合遥感数据获取的城市下垫面特征信息,在明确上海市近地面CO₂浓度空间分布格局的基础上,进一步定量分析其对城市下垫面特征的响应机制.结果表明： 上海市近地面CO₂浓度为(443.4±22.0) μmol·mol^-1,城市中心CO₂浓度比郊区平均高12.5%(52.5 μmol·mol^-1).近地面CO₂浓度空间异质性显著,呈现西北高、西南次之、东南低的趋势,总体表现为随着下垫面城市化水平的降低而降低. 城市下垫面植被覆盖率(C_Veg)是城市近地面CO₂浓度的重要指示因子,两者呈现负相关;不透水层覆盖率(C_ISA)次之,两者呈正相关.CO₂浓度（C_CO2）与C_ISA及C_Veg的相关性(R²)在缓冲距离为5 km时同时达到峰值,三者之间的定量关系可通过建立逐步回归方程表征：C_CO2=0.32C_ISA-0.89C_Veg+445.13 (R²=0.66, P<0.01).
     

外源Ca2+对水杨酸诱导番茄抗灰霉病的增效机制

探讨了外源Ca²⁺对水杨酸(SA)诱导番茄抗灰霉病的增效机制.以番茄灰霉病敏感型品种‘L402’幼苗为材料,分别进行H₂O(对照)、SA、SA+Ca和SA+EGTA(Ca²⁺螯合剂)处理,期间(1～5 d)分析各处理植株叶片活性氧(ROS)含量,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及病程相关蛋白编码基因PR1、PR2和PR3表达水平的变化,并调查处理3 d后灰霉病情指数.结果表明： 与对照(病情指数为74.8)相比,SA、SA+Ca和SA+EGTA处理的植株叶片灰霉病的病情指数分别为46.9、38.5和70.3;SA处理明显提高叶片ROS含量以及苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,这些参数在SA+Ca处理的植株中被进一步提高,但在SA+EGTA处理的植株中则被降低;SA处理明显提高了PR1、PR2a和PR3b的表达水平,Ca²⁺进一步加强了这一效果,而EGTA则起抑制作用.SA或SA+Ca处理期间的PR2b和PR3a表达较未处理的对照上调了1～2倍,而PR1、PR2a和PR3b上调了2～5倍.表明Ca²⁺对SA诱导番茄抗灰霉病具有增效作用,其机理至少与Ca²⁺和SA协同作用促进ROS形成有关,而ROS作为信号分子增加植株抗病相关酶活性以及PR1、PR2a和PR3b等防卫基因的表达.     

原癌基因FOS蛋白、雌二醇及其受体在中国林蛙不同时期精巢中的表达

用免疫细胞化学方法检测了原癌基因FOS蛋白、17β-雌二醇（E₂）和雌激素受体（ER）在中国林蛙生精周期中不同时期精巢内的表达定位。结果显示：在中国林蛙生精周期的Ⅰ—Ⅴ期，E₂和ER在精原细胞、精母细胞、精子细胞、精子、支持细胞和间质细胞内均有表达。在不同时期的精巢中，E₂和ER在生精细胞的定位具有一致性：在Ⅱ—Ⅲ期，精子细胞的E₂和ER阳性表达最强；在Ⅲ期，精子中E₂和ER阳性反应强度显著高于Ⅳ—Ⅴ期（P＜0.01)。在生精周期的Ⅰ—Ⅴ期，支持细胞中，E₂和ER表达强度经历由强减弱再增强的变化过程。在生精周期的Ⅲ期，间质细胞中E₂和ER阳性反应强度高于其他各期。除精子外的生精细胞，支持细胞和间质细胞内均有FOS阳性反应，其表达强度呈现阶段性变化。     

云南哀牢山平河黑长臂猿栖息地乔木结构分析

采用样方方法对栖息于云南省哀牢山平河（E 101°17′16.1″, N 24°20′09.5″, 海拔2 600 m）的黑长臂猿 (Nomascus concolor) 栖息地乔木层结构进行了调查。调查中共记录到乔木57种隶属于23科37属；木质藤本植物9种隶属于6科8属。优势科主要为杜鹃花科（Ericaceae）、木兰科（Magnoliaceae）、山茶科（Theaceae）和壳斗科（Fagaceae）植物。主要树种重要值排序表明，露珠杜鹃（Rhododendron irroratum）为该地区最主要的优势种，在各坡位中均有广泛分布。乔木的多样性指数、均匀度指数在沟底明显降低，而乔木1层和2层所占的比例以及木质藤本的平均多度均随着坡位的下降而升高。与其他地区的长臂猿相比，哀牢山黑长臂猿的活动程度较低（10—22 m），果实性食物种类较少。     

异源副粘病毒感染对雏鸭血清抗氧化酶活性的影响

以雏鸭为试验对象,研究不同来源的副粘病毒感染对雏鸭血清中抗氧化酶活性的影响。选择20日龄健康雏鸭100只,随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,Ⅰ组为对照组,皮下注射0.5 mL/只生理盐水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别皮下注射0.5 mL/只稀释的鸡源、鹅源及鸭源副粘病毒SPF胚液。分别在攻毒后7、14、21、28 d时,随机抽取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组雏鸭各5只进行血液采集与血清分离,测定雏鸭血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)的活性与含量,研究异源副粘病毒感染对雏鸭血清中抗氧化酶活性的影响,以及脂质过氧化程度与抗氧化酶活性的变化趋势。结果表明,在攻毒后不同时间内,感染异源副粘病毒的雏鸭血清中的SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA活性与含量变化显著不同,揭示异源副粘病毒对雏鸭血清自由基代谢产生了不同程度影响,脂质过氧化程度与SOD、GSH-Px活性密切相关。     

4种禽流感病毒M2e多肽的串联表达和小鼠口服免疫效果

为研制广谱性禽流感口服疫苗,将4种禽流感病毒特异的基质蛋白2胞外区(matrix protein 2 ectodomain,M2e)多肽与黏膜免疫佐剂CTA1-DD串联,原核表达并纯化CTA1DD-AVI4M2e融合蛋白。以200 μg融合蛋白CTA1DD-AVI4M2e口服免疫BALB/c小鼠,结果显示实验组肠液IgA抗体效价和血清IgG抗体效价比对照组显著升高,血清中特异性IgG抗体效价达约360倍。分割的3段肠样中：第1段浸出液IgA抗体效价约为360倍,第2段约为120倍,第3段约为 9 720 倍。结果表明,本研究制备的CTA1DD-AVI4M2e具有显著口服免疫效果,为后续研究提供了基础。     

miR-10b对滑膜成纤维细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及分子机制

目的:探讨miR-10b对类风湿性关节滑膜成纤维细胞(RA-FLS)炎性因子分泌、增殖、侵袭和迁移的影响及其分子机制。方法:首先,分离原代培养FLS细胞并进行microarray,筛选RA和OA中差异表达的miRNA分子。然后,用real-time PCR对筛选得到的结果进行验证,进而通过生物信息学分析、细胞转染等方法明确miR-10b在FLS细胞中下调的分子机制。最后,采用MTT比色法、划痕实验和Transwell实验等检测miR-10b对其FLS细胞增殖、侵袭和迁移水平的影响。结果:与OA FLS相比,芯片筛选发现176条miRNA在RA-FLS中上调,204条下调;其中,miR-10b在RA-FLS细胞中受肿瘤坏死因子(TNF-α)等多种炎性因子以NF-κB依赖的方式进行调控;miR-10b的下游靶基因为TAK1和TLR4,通过对这两个靶基因的调控,miR-10b一方面可以促进TNF-α的分泌和NF-κB的活化入核,从而激发TNF-α→NF-κB→miR-10b→TNF-α/NF-κB环路;另一方面促进FLS表面TLR4的表达以及LPS对于FLS的刺激作用,激发LPS→NF-κB→miR-10b→TLR4环路。此外,miR-10b的下调可促进FLS细胞的增殖、侵袭和迁移。结论:miR-10b在RA-FLS细胞中显著下调,其通过参与信号环路的调节可影响FLS细胞的炎性细胞因子分泌及其增殖、侵袭和迁移。