拉达克轮丝菌TGase在大肠杆菌中的分子改造

【背景】谷氨酰胺转氨酶是一种能够催化酰基转移反应的酶,催化各种蛋白质分子之间或之内发生交联反应,在食品、化妆品、医药等领域具有重要的潜在价值。【目的】克隆来自拉达克轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum) B1的谷氨酰胺转氨酶(TGase)基因并对其进行分子改造,使其在大肠杆菌中获得高效异源表达。【方法】分别克隆来自拉达克轮丝菌谷氨酰胺转氨酶的自身前导肽(pro)和除前导肽以外的成熟谷氨酰胺转氨酶(TGase)基因,以pET-22b为表达载体构建pro、TGase共表达和融合表达两种表达模式,在这两种表达模式的基础上进一步用定点突变的方法对成熟TGaseN端前4个氨基酸进行改造,检测不同表达模式以及突变对酶活的影响。【结果】当采用前导肽与TGase共表达时,可以直接得到活性形式的TGase,比酶活达到37.71 U/mg。在融合表达的基础上,将TGaseN端前3个氨基酸DSD突变为AAA,比酶活达到14.04U/mg,相较于原始表达模式提高了14.05%。【结论】前导肽与TGase共表达可以直接产生活性TGase,对于融合表达模式,合适位点的突变有利于提高TGase酶活。     

嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶活性位点的确立

【目的】通过定点突变确定嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶的活性催化位点。【方法】根据序列比对和GH53家族的结构信息选择可能的催化活性位点,利用重叠PCR法构建定点突变体,采用薄层层析(TLC)法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测各酶蛋白活性。【结果】通过重叠PCR法成功构建了7个位点的突变体,其中第150和159位的氨基酸突变对活性改变甚少或几乎没有,而第151和231位谷氨酸的羧基基团的改变以及双位点突变体E2Q则导致其对各种底物催化活性的丧失,说明位于β4和β7折叠的C末端的E151和E231的羧基基团作为功能基团参与了催化反应。【结论】E151和E231分别是新型甘露聚糖酶AaManA的酸碱催化位点和亲核催化位点。     

通过易错PCR提高鼠伤寒沙门氏菌丙氨酸消旋酶催化活性

[目的] 通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。[方法] 利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alr_St的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤层析法分析酶蛋白寡聚化状态,并采用HPLC检测酶蛋白的动力学参数。[结果] 经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白StAlr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,k_cat/K_m值分别是StAlr的2.01和3.68倍;而突变体A3V则对底物L/D-丙氨酸或L/D-丝氨酸的K_m、k_cat和k_cat/K_m值均有较大幅度的改变,其k_cat/K_m值分别是StAlr的105.51、97.36、4.63和10.73倍。凝胶过滤层析结果显示,突变体A3V在蛋白含量极低时就呈现出单体和二聚体共存状态,且随着蛋白含量的增加,其向二聚体状态迁移的速率最为明显。[结论] 丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点。     

假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶的晶体制备及X-射线衍射研究

摘要:【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及X-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核表达,采用Ni-NTA亲和层析法和分子排阻色谱法纯化蛋白,289 K下采用座滴法进行晶体筛选和制备,在低温100 K下通过X-射线衍射仪(Rigaku MicroMax-007 HF)收集晶体衍射数据。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了适合晶体生长的蛋白BpEctD。通过筛选最终在蛋白浓度为6.5 mg/mL及含有0.2 mol/L MgCl2·6H2O,0.1 mol/L Bis-Tris pH6.5,25% (W/V) 聚乙二醇3,350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体,其大小约为360 μm×240μm×60 μm,并在100K下成功收集了衍射数据,晶体衍射分辨率为2.40,空间群为三斜晶系P1,晶胞参数为a=45.18,b=58.87,c=68.81,α=77.48°,β=86.03°,γ=66.97°,每个不对称单位中含有2 个BpEctD单体,马修斯系数为2.44 3/Da,溶剂含量约为49.53%。【结论】衍射数据的成功收集为假坚强芽孢杆菌OF4四氢嘧啶羟化酶三维结构的解析奠定了前期基础,将有助于阐明四氢嘧啶羟化酶的催化机制。     

转运蛋白提高凝结芽孢杆菌酸耐受性

光学纯乳酸作为可降解生物材料——聚乳酸(polylactic acid,PLA)的前体物质,正在受到广泛关注。乳酸发酵过程中酸性产物的积累会影响菌株的生长,提高菌株酸耐受性具有重要意义。本研究以乳酸生产菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) DSM1为出发菌株,通过对凝结芽孢杆菌DSM1及其乳酸脱氢酶双敲除菌株(DldhL1DldhL2)进行比较转录分析,筛选酸耐受相关的转运蛋白基因。对关键基因RS16330、RS06895、RS16325、RS10595、RS00500、RS07275、RS10635及RS01930进行实时定量PCR分析,发现基因RS06895、RS10595、RS00500和RS10635在发酵12 h和24 h转录水平显著增强。过表达RS10595基因的菌株,在中性(pH 6.0)条件下生长状况和发酵性能均受到抑制,但在酸性条件下(pH 4.6),其乳酸生成相比对照组显著提高。上述结果表明,RS10595基因与菌株DSM1的酸耐受性密切相关。本研究有助于进一步探究凝结芽孢杆菌酸耐受的机制,也为构建耐酸菌株提供了基础。     

改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变

目的:目的DNA片段中快速构建位点不同的定点双突变体。方法: 借鉴DNA shuffling技术中DNA小片段延伸扩增获得全长DNA片段的工作原理,与常规基因定点突变技术相结合,改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变。结果:对嗜酸热脂肪杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)Tc-12-31的甘露聚糖酶基因AamanA中两个可能的活性位点E151和E231进行双点突变,先后经过无引物和有引物两步PCR,扩增获得全长DNA,测序结果表明得到预期的定点双突变体;酶活性检测和薄层层析结果表明双点突变体丧失了酶的活性。结论: 改良的重叠PCR技术,能经济、简便、高效地获得双点定点突变体,在酶的催化机理的阐述、蛋白质结构改造等分子生物学领域中具有较高的应用价值。     

丙氨酸消旋酶C-端结构域重组体的构建及其功能初探

[目的]将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能.[方法]利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测重组酶蛋白的酶学特性,借助分子筛和HPLC液相色谱分析其聚合状态及动力学...