白色念珠菌CRK1基因的敲除及其功能研究

在筛选白色念珠菌促分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）相关蛋白激酶基因的过程中,得到了ＣＲＫ１（ＣＤＣ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １）基因。利用同源重组原理,敲除了ＣＲＫ１双拷贝基因片段,构建了ＣＲＫ１纯合缺失株,发现ＣＲＫ１基因的缺失影响到白色念珠菌的生长速度,絮凝生长和形态发生。     

逆转座子样元件Tca1用于白色念珠菌的分类鉴定

已分离到一中等重复序列以及具有逆转座子样结构的元件Tcal(Transposon Candida albicans)。Tcal两端存在两个完全相同同向排列的序列LTR(Long Terminal Repeat)388bp,中间被一5.5kbDNA片段隔开。以alpha及Tcal为探针对40多种来自美国和中国的临床分离到的致病菌株进行杂交分析,根据杂交图谱,这些白色念株菌可被分成若干组,令人感兴趣的是来自同一地区菌种的遗传相关性比来自不同地区的大。比较URA3等基因的杂交结果,支持这种分析。尚未观察到alpha重复序列与其他酵母菌染色体DNA杂交的杂交条带,认为Tcal元件也许与C. albicans的遗传进化及其致病性有某种内在联系。     

简并PCR法用于白色念珠菌MAPK新基因的筛选

ＭＡＰＫ很可能在白色念朱菌形态发生中起作用。根据所有ＭＡＰＫ保守区域ＶＩＢ和ＩＸ的氨基酸序列合成了两个简并的引物,以ＳＣ５３１４染色体ＤＮＡ作为模板,在非严谨条件下（３７℃）进行ＰＣＲ以筛选白色念球菌中新的ＭＡＰＫ基因,一共测定了１００个ＰＣＲ基因片段的序列,在２５个新基因片段中,筛选到两个新的ＭＡＰＫ基因片段,以这两个基因片段为控针从染色体基因库中克隆了对应的全长基因,序列分析表明它们是新的ＭＡ     

C1n3缺失对酿酒酵母生长的影响

Cln3是酿酒酵母G1期周期蛋白中的一种,为了研究Cln3在细胞周期与形态发生中的作用,我们构建了酿酒酵母CLN3基因的缺失株,并对其表型进行了分析。结果显示,cln3缺失株对α信息素的敏感性增强,α信息素诱导的细胞周期停滞现象明显大于野生型菌株,这种增强作用不受Sgvl因子的影响。同时,与野生菌相比cln3缺失株的细胞形态也有明显变化,双倍体cln3缺失株细胞的顶端生长能力增强而单倍体细胞的侵入生长能力则受到抑制。结果表明,与酿酒酵母的另外两个G1期周期蛋白Clnl、Cln2不同,Cln3在形态发生中有其独特的功能与作用方式。     

CEK2和CSK1基因的敲除对白色念珠菌形态的影响

为了研究白色念珠菌中克隆到的两个新MAPK基因CEK2和CSK1的功能,我们利用同源重组的方法分别敲除了这两个基因。这两个基因的缺失都在一定程度上促进了白色念珠菌的菌丝形成;而在白色念珠菌中表达CEK2基因,转化株形成菌丝的能力比野生型菌株弱。利用酿酒酵母two-hybridsystem检测Cek2和Csk1与Hst7(Ste7同源物)、Cph1(Ste12同源物)的相互作用,结果表明Cek2和cSK1并不与白色念珠菌菌丝形成MAPK途径的Hst7和Cph1直接作用,CEK2和CSK1基因抑制菌丝的形成很可能并不是通过白色念珠菌菌丝形成MAPK途径来实现的。