对微分离的大豆单染色体的克隆及其PCR产物的原位杂交分析(英文)

通过玻璃针分离法从大豆 (GlycinemaxL .)根尖细胞中期分裂相中显微分离出一条染色体 ,经Sau3A人工接头介导的两轮PCR后 ,将其第二轮扩增产物克隆到质粒载体上 ,构建了单染色体质粒文库。经分析 ,该微克隆文库包含约 2 0 0 0 0 0个重组子。随机挑选 1 78个重组子进行鉴定 ,证明该文库的插入片段主要介于 2 0 0～ 1 80 0bp之间 ,平均大小 830bp ;其中 ,中、高拷贝重复序列占 44% ,单、低拷贝序列占 56%。微分离染色体体外扩增产物的原位杂交分析表明它们来自于大豆基因组 ,然而却未能将其只标记在该条微分离的染色体上     

葡聚糖酶及其在植物中的发育调节和防卫反应

葡聚糖酶又称昆布多糖酶,胼胝质酶。它的底物葡聚糖在植物中广泛分布,葡聚糖酶的作用即与此类物质的分布相关,且常与植物许多发育过程有联系。从六十年代起,就对葡聚糖酶及其作用进了研究,时至九十年代,对它的研究已涉及到分类、生理、抗病、分子生物学、基因工程等方面。目前主要集中在它的分子生物学、抗病基因工程及雄性不育基因工程的实际应用。以下就这些方面的研究进展做一综述。     

转β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因棉花

为了提高棉花的抗枯、黄萎病的能力,用花粉管通道法,将烟草β-1,3-葡聚糖酶基因和菜豆几丁质酶基因导入棉花,获得了抗卡那霉素的转化植株。经PCR、PCR－Southern Blot检测,证明两种基因已插入到棉花基因组中。     

水稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其在玉米中的功能验证

以水稻基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了水稻谷蛋白基因G t1的启动子序列,并将其构建到带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物表达载体上,用微束激光穿刺法转化玉米的受体组织,通过外源基因瞬时表达的方法验证了该启动子的功能,结果表明在胚乳中有较强的表达,而在其它组织中表达很弱;证明了水稻谷蛋白基因G t1的启动子在不同物种玉米中同样具有胚乳特异表达的功能。为这一胚乳特异启动子的广泛利用提供了理论依据。     

烟草脱外壁花粉的电激基因转移

以 β-葡糖苷酸酶 GUS 基因作为报告基因 ,通过瞬间表达的检测 ,比较了烟草 Nicotianatabacum L . 脱外壁花粉、未萌发与萌发花粉的电激导入效果 ,探讨了不同电激条件及启动子对外源基因瞬间表达的影响 .结果表明 :当脉冲时间常数为 13 ms时 ,导致脱外壁花粉和萌发花粉生活力下降约50 %的电场强度分别为 750 V/ cm和 12 50 V/ cm,在此条件下电激 ,二者的导入效果最好 .脱外壁花粉的GUS基因表达水平约为萌发花粉的 5倍、花粉粒的 30倍 .玉米花粉特异启动子 Zm13- 2 60 能启动 GUS基因在脱外壁花粉和萌发花粉中高效表达 ,而 Ca MV 35S的启动活性很低     

云杉针叶三磷酸腺苷酶活性的超微细胞化学定位

用磷酸铅沉淀技术研究了云杉幼龄针叶及成龄树针叶细胞的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性定位。从形态结构上可以看到,种子萌发的幼龄针叶细胞的细胞壁较薄, ATP酶活性反应产物磷酸铅颗粒主要分布于细胞质和细胞质膜上。成龄针叶细胞壁较厚,内质网等细胞器发达,ATP酶主要在细胞壁有较高的活性反应。两者细胞的液泡及细胞核中也有少量定位。幼龄针叶ATP酶活性较成龄针叶的活性较弱, 这种活性变化与不同发育时期叶的生理功能有关。     

初始培养条件对定兴芥小孢子胚胎发生的影响

本文探索了油菜花药培养中小孢子胚早期发育的适宜条件。花药分步悬浮法第一培养基的简化实验表明,小孢子胚在仅含有20%蔗糖的空白培养基上的诱导率(212%)与对照的(202%)无显著差异。这样,第一培养基便从原Keller培养基简化为不含大量、微量和有机元素而仅含有20%蔗糖的水溶液,并且,花药第一阶段的培养时间从原来的3—5天减少到1.5—2天。此外,研究了花药在蔗糖水溶液上的滞留时间对小孢子胚胎早期发育的影响。滞留36～48小时,小孢子胚的诱导率(135%)最佳。考察小孢子胚胎早期发育的状况与不同滞留时间的关系则发现,36—48小时内每100个活细胞里,膨大细胞约占70%。这表明,早期培养时,花粉只要膨大而不需分裂即可转入第二阶段培养,便可获得较高产率的胚状体。     

小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd:YAG激光微束将处于丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收.将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增.Southem杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组.用一系列(42对引物)位于6B染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证.结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体.将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGET-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×105、2.74×105和2.93×105个重组子克隆.每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证.结果显示;插入片段大小在300～1800之间,平均大小为820～870bp,其中43%～48%的克隆为低/单拷贝序列,42%～47%为中/高拷贝序列.本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础.     

在三叶橡胶花药培养中体细胞与小孢子的关系

研究了三叶橡胶花药体细胞的愈伤组织化与花粉胚形成的关系。在只能促进花药体细胞增殖的培养基上,小孢子没有进一步发育而空瘪;在抑制体细胞增殖的培养基上,无论是花药体细胞组织或小孢子都未能进一步发育,小孢子逐渐解体,而在能诱导体细胞有一定程度的发育,同时又能诱导小孢子发育的培养基上,约有10—20%的花粉形成多细胞球。它们的发育与体细胞密切有关。还发现,在接种培养基中加入1—2毫克/升a—萘乙酸对体细胞与小孢子发育均有良好效果。对胚状体的细胞学观察表明:这些胚状体是单倍体(2n=18)。此外,花药接种前冷冻预处理(11℃24小时及3—5℃20小时),对小孢子有明显的不利影响。在经冷冻预处理后所得胚状体中,有相当多的二倍性细胞分裂相出现。这些胚状体可能来源于体细胞组织。