细菌Ⅱ组内含子（GroupⅡintron）的转移机制

摘要: 约14年前在真核生物中发现的Ⅱ组内含子不仅具有催化功能,而且是可移动的逆转录元件。近年来研究发现细菌中也有可移动的Ⅱ组内含子,它们能够逆转录归巢进入同源无内含子的等位基因位点或者逆转录转座进入非等位基因位点。本文试图从细菌Ⅱ组内含子编码蛋白的活性功能域的组成与Ⅱ组内含子转移发生途径之间的联系,综述已知细菌Ⅱ组内含子主要的移动机制。同时,依据作者多年来研究海洋蓝细菌Ⅱ组内含子编码蛋白对Ⅱ组内含子剪接机理的结果,探讨了海洋蓝细菌Ⅱ组内含子是否会发生转移以及可能的转移方式,探讨了Ⅱ组内含子在生物基因组中发生转移的生物学意义。     

异源生物中筛选高剪接活性Intein系统的建立

原始物种体内蛋白质内含子（intein）介导的自催化蛋白剪接反应以100%效率进行.当这些蛋白质内含子被克隆入异源物种时,其剪接效率往往大大降低,绝大多数甚至完全失去剪接能力.本研究根据蛋白质内含子剪接活性与蛋白质外显子（extein）C端第1个保守氨基酸直接相关的特点,设计含有所有这些保守氨基酸的多个短的蛋白质外显子序列,通过PCR引入到卡那霉素抗性蛋白（KanR）的不同位点中,在此外显子中克隆入相应的蛋白质内含子,构建在大肠杆菌中依赖卡那霉素抗性来筛选高剪接活性蛋白质内含子的系统.结果显示,卡那霉素平板上菌落生长的结果与Western印迹检测的结果基本一致.说明建立的筛选高剪接活性蛋白质内含子系统成功.这种含有可选择蛋白质外显子的筛选系统,将蛋白质剪接与卡那霉素抗性相结合,直接从平板上观测剪接结果,成为快速、稳定筛选在异源物种中具有剪接活性蛋白内含子的新手段.     

DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究

蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白（内含子C端-外显子-生物素结合蛋白）形成DNA 蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体（Flag-内含子N端）发生剪接反应的DNA 蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签（Flag）,从而被抗旗帜标签抗体纯化柱（Anti Flag antibody M2 agarose）筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA 蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因“突变库”,即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。     

重组杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT的二级结构表征

重组蛛丝纤维作为一种性能优异的生物材料,具有良好的生物相容性,在生物医学工程领域具有极大的潜在应用价值。已有研究表明,重组蛛丝蛋白可用作血管、神经导管及药物载体等,但其生物学功能仍有待研究。本研究以大腹园蛛基因组为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得大腹园蛛梨状腺丝（piriform spidroin: PySp）一个完整重复区（Rp）编码序列;此Rp模块与MiSpNT/CT模块重组,构建微小型杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,成功在大肠杆菌BL21中高效表达,借助8 mol/L尿素裂解缓冲液进行变性纯化,得到纯度较高的杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,产量约100 mg/L。CD图谱显示,MiSpNT-PySpRp-MiSpCT蛋白质溶液主要以α-螺旋和无规卷曲形式存在,随着溶液pH值降低,部分α-螺旋向β-折叠转变;红外光谱显示,在自然成丝及冻干过程中,部分α-螺旋转化为β-折叠,符合天然蛛丝蛋白成丝过程的二级结构变化特征。本研究结果为今后获得具有天然蛛丝纤维优异性能的人工重组蛛丝纤维材料提供一种新的可能。     

Ⅱ组内含子(Group Ⅱ Intron)的分布及多样性

Ⅱ组内含子(group Ⅱ intron)存在于原生生物、真菌、藻类、植物细胞器以及细菌和古细菌基因组中.在体内,Ⅱ组内含子可通过两步连续的转酯反应从前体RNA中自剪接,并连接两 侧外显子.许多Ⅱ组内含子的剪接反应是由蛋白质辅助完成的,这种蛋白质有的是由内含子编码,有的是由宿主基因编码.Ⅱ组内含子能够有效地归巢进入无内含子的等位基因,也能 够以低频率逆转座进入非等位基因.转座过程依赖内含子RNA和内含子编码的蛋白质（内切核酸酶活性和逆转录酶活性）.本论文在总结Ⅱ组内含子最新研究成果的基础上,分析Ⅱ组内含子可能的起源和进化途径     

一种提取蜘蛛基因组DNA的有效方法

介绍了用尿素法提取蜘蛛基因组DNA。通过与其他DNA提取方法相比较,证明尿素法具有可在室温条件下进行、DNA得率高、完整性好、简单快速等优点。以提取的DNA为模板进行PCR扩增,获得预期大小的、高重复、高GC含量的编码蜘蛛牵引丝蛋白基因的DNA片段。     

黄绿卷毛菇对其生境土壤微生物群落结构的影响

黄绿卷毛菇Floccularia luteovirens是青藏高原特有的珍稀食药用真菌,具有较高的经济价值和生态功能,其对土壤微生物群落的调控及稳定具有促进作用。本研究采用IlluminaMiSeq测序技术,对9份黄绿卷毛菇菌窝土壤(F)及9份周围无菇土壤(CK)微生物群落组成和多样性进行分析。结果表明,黄绿卷毛菇生境土壤中共获得25门、61纲、99目、174科、442属细菌。与周围无菇土壤相比,黄绿卷毛菇增加了土壤细菌的多样性(Shannon指数6.55)和丰富度(Ace指数8104.25);变形菌门Proteobacteria(F:49.83%,CK:37.85%),鞘脂单胞菌属Sphingomonas(F:16.17%,CK:13.28%)的相对多度均显著升高。PICRUST功能分析表明,黄绿卷毛菇生境土壤中代谢功能系统为细菌群落的主要通路,在F组和CK组中所占比例分别为38.66%和13.08%。生境土壤中共获得真菌15门、38纲、93目、204科、304属。与周围无菇土壤相比,黄绿卷毛菇降低了土壤真菌的多样性(Shannon指数1.06)和丰富度(Ace指数1 269.88)...     

拟南芥中一个新的snoRNA基因簇的鉴定及结构分析

在拟南芥中发现和鉴定了Z2 snoRNA基因簇, 该基因簇由4个相同的 Z2 snoRNA 基因组成,分别命名为Z2a, Z2b, Z2c和Z2d. 在Z2 snoRNA基因簇的基因间隔区中没有发现已知的植物snoRNA基因保守的启动元件,因此,Z2 snoRNA基因簇是由一个上游启动子控制转录的. 对Z2 snoRNA基因间隔区序列的二级结构分析也表明,在3个基因间隔区中都编码一种与酿酒酵母snoRNA前体切割加工的识别信号类似的发夹结构. Z2 snoRNA基因簇的发现,揭示出植物snoRNA基因具有多拷贝的特点,并为进一步研究植物snoRNA基因簇的转录和转录后的加工机制提供了一个良好的研究体系.     

利用小肽控制的基于蛋白质内含子非层析标签制备重组蛋白(英文)

基于蛋白质内含子的蛋白质纯化自我断裂标签已经被广泛使用超过15年之久.但这一系统体内表达过程的提前断裂一直是限制这一技术广泛应用的瓶颈,特别是在需要高温表达和长表达周期的真核表达系统中.本研究介绍了一种利用小肽控制的基于蛋白质内含子和非层析标签ELP(elastin-like polypeptide)的自我断裂系统.在这一系统中,蛋白质内含子的体内外活性严格受到其结构互补小肽控制.在体内表达不含有互补小肽时,蛋白质内含子不具有活性;而在体外添加结构互补小肽,蛋白质内含子结构恢复并发生C端断裂反应释放目的蛋白.由于非层析标签ELP的引入,因此整个纯化过程可以简单地通过几步机械沉淀完成.此外,这一系统反应pH、小肽与前体蛋白之间的摩尔比及断裂速率也一并进行了系统的研究.     

断裂蛋白质内含子的剪接机制、起源和进化

蛋白质内含子(intein)是具有自我催化活性的蛋白质. 翻译后,通过蛋白质剪接从蛋白质前体中去掉,并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)形成成熟蛋白质. 断裂蛋白质内含子(split intein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂,形成N端片段和C端片段,分别由基因组上相距较远的两个基因编码. 现在已知,它仅分布于蓝细菌和古细菌中. 断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段通过非共价键(如静电作用)相互识别,重建催化活性中心,介导蛋白质反式剪接. 断裂蛋白质内含子的发现进一步深化了人们对基因表达和蛋白质翻译后成熟过程复杂性的认识,而且它在蛋白质工程、蛋白质药物开发和蛋白质结构与功能研究等方面有非常广泛的应用. 本文试图综述断裂蛋白质内含子的分布、结构特征和剪接机制,并分析其可能的起源和进化途径.