一株祁连野生羊肚菌多基因联合分子鉴定及其生物地理分析

【背景】青海野生羊肚菌野生资源丰富,但物种识别度低,相关研究滞后。【目的】鉴定识别采集自青海祁连的野生羊肚菌并分析其生物地理。【方法】利用形态学、多基因谱系一致性系统发育学物种识别法与多基因分子系统学相结合的方法,鉴定野生羊肚菌并分析该物种分化时间和重建祖先区域。【结果】野生羊肚菌菌株MQL-1子实体菌盖呈黄褐色,圆顶,菌柄呈白色、中空,形似羊肚菌,孢子大小为（21.17±4.33）μm×（14.26±3.25）μm,菌丝直径（13.95±3.19）μm。系统发育分析结果表明分离到的菌株MQL-1与羊肚菌属中的黄色羊肚菌类群的内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列相似性高达99%,多基因谱系一致性系统发育学物种识别法将MQL-1识别为粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）。分化时间估算和祖先重建结果表明青海祁连粗柄羊肚菌MQL-1与云南M.crassipes M10的分化时间12.75 Mya （百万年前）,其重建的最可能的祖先区域为印度（52.49%）。【结论】本研究得到了一株青海祁连地区粗柄羊肚菌菌株并确定了其正确的科学命名,丰富了青海省羊肚菌资源信息数据库,为后续的工作奠定了基础,也为真菌研究提供新思路。     

气候变化背景下1964-2015年秦岭植物物候变化

以1964-2015年物候观测数据为基础,选取17种含乔木、灌木及藤本树种为研究对象,分析探讨了气候变化背景下秦岭地区植物物候变化规律及其差异性。结果表明:(1)52年来,秦岭地区物候始期普遍呈提前趋势,提前速率1.2d/10a,物候末期普遍呈推迟趋势,推迟速率3.5d/10a,物候生长期普遍延长;(2)秦岭地区物候突变发生于20世纪80年代,始期于1985年,末期于1984年。突变后,物候特征发生了显著变化,始期的提前速率较突变前显著加快,末期由突变前的提前趋势转变为极显著的推迟趋势,且变化速率和显著性均高于始期;始期与末期变化均表现出"趋同效应";物候年代际变化趋势显示,始期自2001-2005年起提前速率减缓,植物对气候变化的响应表现出适应性及滞后性。(3)秦岭物候变化存在树种差异,3大类树种始期的提前速率呈藤本、乔木、灌木依次增大,而末期的推迟速率则呈藤本、灌木、乔木依次减小。(4)秦岭物候变化存在南北差异,北坡始期的提前速率均高于南坡,而南坡末期的推迟速率均高于北坡。     

PRP8蛋白质反式剪接系统的建立

真菌病原体Cryptococcus neoformansAD血清型剪接体蛋白PRP8蛋白质内含子是目前 发现的第2个存在于真核生物体核基因组中的蛋白质内含子.它的宿主基因prp8编码的PRP 8蛋白作为剪接体的1个组分,是1个高度保守的mRNA剪接蛋白.将组氨酸标签插入克隆自真菌病原体Cryptococcus neoformans AD血清型的PRP8蛋白质内含子中,并将该蛋白质内含子进行人工断裂,获得断裂蛋白质内含子,在大肠杆菌中鉴定其剪接活性.研究结果表明：所获得的改造型蛋白质内含子均表现出高效的剪接活性.利用此Cryptococcus neoformansAD血清型PRP8 断裂蛋白质内含子,成功构建了蛋白质反式剪接系统.这一反式剪接系统可用于其他蛋白质的连接与合成,有望成为蛋白质工程中的一种有用工具.     

马铃薯卷叶病毒的提纯

本文提出了一个应用液氮冷冻,一步提取,蔗糖垫层差速离心,Sephadex G-200柱层析以及蔗糖密度梯度离心法纯化马铃薯卷叶病毒的程序,改进后的马铃薯卷叶病毒提纯方法,使病毒产量达到1.18mg/kg酸浆组织,病毒提取物纯度比差速离心者更高,20％蔗糖垫层差速离心能够更加有效地去除宿主细胞成份,纯化病毒的OD260/280,260/240比值分别达到1.77和1.43。     

基于卡那霉素抗性建立的研究I类内含子结构与功能关系的系统

Ⅰ类内含子（group I intron）是研究RNAs结构与功能关系的理想元件, 在 解释RNA折叠理论、催化机制等方面起着重要作用;对其结构与功能关系的研究也 因此成为一个非常重要的课题. 本研究建立了一个基于卡那霉素抗性进行Ⅰ类内含子结构与功能关系研究系统,将源于海洋蓝细菌Nostoc punctiforme（Npu）核糖核酸还原酶基因（ribonucleotide reductase,Rir）中的1个Ⅰ类内含子插入到pDrive质粒的卡那霉素抗性基因（kanamycin resistance gene,KanR）内构建得pKR12质粒并转化大肠杆菌（E.coli）. 只有内含子剪接的阳性克隆才能生成 KanR蛋白并在Kan抗性平板上生长. 结果显示,pKR12转入E.coli后不能在Kan抗性 平板上生长, RT-PCR检测仅可见前体带, 表明插入到KanR中的Npu Rir内含子没有发生剪接. 随后通过易错PCR建立内含子的随机突变库并用Kan抗性筛选进行定向演化, 产生有剪接活性的内含子突变体, RT-PCR检测显示剪接发生. 由于内含子剪接活性的改变可通过Kan抗性变化在LB平板上得以反映, 因此该系统有望成为简单快速地研究Ⅰ类内含子结构与功能关系的有利工具.     

次壶腹腺丝蛋白功能模块的研究

蜘蛛丝是天然的生物材料,具有潜在的巨大应用价值。研究蜘蛛丝蛋白质的结构与功能,有助于破解蜘蛛丝蛋白质的成丝机理,为制备优良材料学性能的仿生蜘蛛丝纤维提供理论依据。以MiSp蜘蛛丝的重复区和C端非重复区蛋白多肽为研究对象,在不同pH值和离子条件下,在体外研究其二级结构与成丝的关系。CD图谱显示:表达纯化的重组蜘蛛丝蛋白R1R2在pH 7.5、6.5和5.5时二级结构相似,均为无规则卷曲,而R1R2CT则主要呈现为α螺旋构象;扫描电镜结果表明:在以上3种pH条件下,只有pH 5.5时R1R2和R1R2CT才形成重组丝纤维,R1R2CT纤维形态较平整,类似于天然蛛丝纤维形态,而R1R2丝纤维则呈条带状,表面粗糙。另外,氯化钠不利于形成形态平整的丝纤维。该成果为研究蛛丝蛋白的成丝机理奠定基础,也为制备仿生蛛丝蛋白纤维提供理论依据。     

大腹圆蛛Fosmid文库的构建及MaSp基因筛选方法的探讨

介绍了构建大腹圆蛛Fosmid基因组文库及牵引丝蛋白(MaSp)基因克隆筛选的全过程.采用改良CTAB法提取大片段基因组DNA,通过自主构建的电洗脱核酸回收装置分离回收30～40kbDNA片段,经补平磷酸化、与pCC2FOS载体连接、体外包装和转染EPI300TM-T1R,首次构建了无偏向性的大腹圆蛛Fosmid文库,其滴度为4.5×105cfu/mL,覆盖基因组倍数为10.以α-32P标记寡核苷酸探针对文库进行初步筛选,获得含MaSp基因的12个阳性克隆.该文库符合Fosmid文库的品质要求,为进一步筛选并研究大腹圆蛛MaSp基因序列奠定了基础.     

定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3 剪接活性的研究

目前,蛋白质内含子在蛋白质工程领域中得到越来越广泛的应用。为提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3(Trichodesmium erythraeum)在异源宿主中的剪接活性,采用易错PCR技术,通过改变反应体系中dNTP、Mg2+、Mn2+的浓度等手段,借助依赖卡那霉素的蛋白质内含子筛选系统进行筛选。Western印迹结果表明:通过定向进化,其中5号突变体的剪接活性从原始的约20%提高至约85%;9号突变体能够避免发生剪接副反应,即N端断裂反应。氨基酸突变位点与剪接活性变化的相关性分析表明:参与α-helix形成的氨基酸的突变极有可能影响蛋白质内含子的断裂反应,参与β-sheet形成的氨基酸的突变则有可能影响蛋白质内含子结构的紧凑性。通过定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3在异源宿主中的剪接活性,进一步验证依赖卡那霉素抗性的筛选系统的可行性,为扩大蛋白质内含子的应用范围奠定基础。     

应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端

蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利用新型断裂蛋白质内含子对蛋白质进行N端标记的新方法.在这个方法中,通过简单的重组表达、标记和纯化得到带有荧光基团的小肽,经过蛋白质反式剪接,荧光基团被标记到蛋白质的N端.初步研究结果显示,标记效率可达到12%.