模拟微重力条件下心肌细胞的体外三维固定化培养

观察心肌细胞体外培养形成三维(3D)组织结构的能力和过程及心肌细胞在模拟微重力状态下的3D固定化培养效果。应用酶消化法从新生的乳鼠心室肌组织获取心肌细胞,以Cytodex3为心肌细胞的3D固定化培养载体,将心肌细胞固定化培养于Spinnerflask中,用扫描电镜观察心肌细胞体外培养形成的3D组织结构;以心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度为观察指标,比较心肌细胞在Spinnerflask及HARV(highaspectratevessel)生物反应器中3D固定化培养的差异。结果显示,心肌细胞不仅能贴附于Cytodex3上生长,且形成了具有同步自律收缩的3D组织样结构;心肌细胞在两种不同培养体系中的细胞接种效率和细胞形态没有明显差异,培养于HARV中的心肌细胞的代谢效率和细胞搏动强度均明显高于Spinnerflask培养体系。体外培养的乳鼠心肌细胞具有形成同步自律收缩的3D组织结构的能力;模拟微重力的培养环境有利于改善心肌细胞3D组织样培养物的代谢和功能 。     

组成型过量表达hTERT对Vero细胞体外培养生物学特性的影响

目的：考察组成型过量表达人端粒酶催化亚单位（hTERT）对Vero细胞在无血清培养体系中的细胞形态、生长和代谢的影响。方法：以组成型过量表达hTERT的Vero细胞系T1为研究对象,以活细胞密度和细胞活力为主要观察指标,结合细胞形态和贴附伸展动态,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养和悬浮培养体系中的细胞生长;以葡萄糖比消耗速率（qglc）、乳酸比生成速率（qlac）、乳酸转化率（Ylac/glc）和谷氨酰胺比消耗率（qgin）为反映细胞代谢的主要观察指标,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养的细胞代谢。结果：hTERT组成型过量表达在降低Vero细胞的贴附伸展能力和对血清的依赖程度的同时,提高了细胞无血清批次培养后期的细胞活力和活细胞密度,并赋予了T1非贴附依赖性生长的能力。hTERT组成型过量表达未对Vero细胞的代谢产生明显的影响。结论：hTERT组成型过量表达可降低Vero细胞的贴附生长依赖性和对血清的依赖程度,是有应用潜力的改良哺乳动物细胞体外培养性状的技术途径。     

一种新型的生物素诱导的真核基因表达调控系统的建立

为建立一种适用于生物制药工业和基因治疗领域的基因表达调控系统,构建枯草芽胞杆菌生物素连接酶(BS-BirA)与转录激活结构域的融合蛋白,以其表达载体为调控载体;在弱化的CMV启动子上游连接BS-BirA特异的操纵子序列,获得响应载体,从而得到响应于生物素的真核基因表达调控系统BS-Biotin-On。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因对该系统进行考察,结果表明,与现有的类似调控系统相比,该系统具有良好的诱导率;可通过调节培养体系中生物素的浓度,实现对目的基因表达水平快速、较高效的调节。上述结果表明,BS-Biotin-On系统可能为外源基因的调控表达提供新的选择。     

一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立

目的：建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统。方法：通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件：大肠杆菌生物素连接酶（BirA）、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白（SA-TetR）和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白（Avitag-VP16）。将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况。结果：随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍。结论：可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统。     

一种基于荧光强度分析的高通量定量检测细胞凋亡方法

根据正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性,用4μmol/L YO-PRO-1（YP）和4μg/ml 碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色96孔板中的细胞样品。分别在485/538 (Ex/Em, nm) 和530/590 (Ex/Em, nm) 的检测波长下借助荧光分光光度计检测细胞样品孔的YP和PI荧光强度。将YP和PI荧光强度值与用荧光显微镜对同一细胞样品细胞凋亡和坏死的定量分析结果相对应,通过对YP荧光强度值与凋亡细胞数的直线回归分析 (r = 0.999,P<0.01),得到依据YP荧光强度值求得凋亡细胞数的直线相关方程。该方法可检测出样品中少至180个的凋亡细胞,具有灵敏度高和快速高效的特点。     

Vero细胞在不同微载体固定化培养中的生长和代谢

目的:比较Vero细胞在不同的商品化微载体中固定化培养的生长和代谢。方法:以Vero细胞在含1%新生牛血清的DMEM/F12中培养的细胞形态、活细胞密度和细胞活力为指标,考察Vero细胞在2D MicroHex、Biosilon、Cytodex1和Cytopore1微载体固定化培养的细胞生长;以葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生产速率(qlac)、谷氨酰胺比消耗速率(qgln)和谷氨酸比生产速率(qglu)为指标,考察Vero细胞在不同微载体固定化培养的细胞代谢。结果:Vero细胞在2DMicroHex、Biosilon、Cytodex1和Cytopore1微载体固定化培养7d的活细胞密度分别为18.4×105cells/ml、21.9×105cells/ml、23.9×105cells/ml和16.2×105cells/ml,生长在Cytodex1表面的Vero细胞分布均匀、形态清晰;Vero细胞在不同微载体固定化培养的代谢指标基本相同。结论:Vero细胞在Cytodex1微载体固定化培养的效果优于其它商品化微载体,可作为目前用于病毒疫苗生产的Vero细胞固定化培养的首选微载体。     

以胶原膜为支架的心肌细胞体外三维培养

将从新生乳鼠心室肌组织获取的心肌细胞接种于鼠尾胶原膜三维支架和组织培养板,以细胞形态、细胞搏动、葡萄糖比消耗率(q_glu)、乳酸比产率(q_lac)、乳酸转化率(Y_lac/glu)、肌酸激酶及乳酸脱氢酶的活力为观察指标,比较心肌细胞在鼠尾胶原膜中三维(3D)培养和组织培养板中二维(2D)培养的差异。培养于鼠尾胶原膜的乳鼠心肌细胞在第5天形成闰盘连接,形成面积约为80mm³、肉眼可见自律性同步收缩的心肌细胞3D培养物。3D培养体系中乳鼠心肌细胞的q_glu、q_lac和Y_lac/glu的均值分别为7.37 μmol/10.6cells/d、2.92 μmol/106cells/d和0.38 μmol/μmol;2D培养体系中乳鼠心肌细胞的q_glu、q_lac和Y_lac/glu的均值分别为7.59 μmol/10.6cells/d、3.83 μmol/10.6cells/d和 0.51 μmol/μmol。两种培养体系中乳鼠心肌细胞的肌酸激酶及乳酸脱氢酶的活力无明显差别。实验结果表明：培养于鼠尾胶原膜的心肌细胞保持正常心肌细胞的代谢活力和收缩功能。     

中国仓鼠卵巢细胞的悬浮适应及代谢特征

目的：通过悬浮适应,使中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）获得悬浮生长的特性,并可在悬浮培养条件下较快地生长。方法：将CHO细胞以3×10^5／mL接种于100mL的三角瓶内,培养时加入1％小牛血清、1g/LPIuronic F-68、25μg／mL硫酸葡聚糖,培养体积35mL,摇床转速90r／min,每24h离心换液,当细胞增殖为2×10^6／mL时传代。结果：经过悬浮适应,细胞的平均比生长速率由适应最初的0．27／d提高为适应后的0．48／d,最大总细胞密度由适应初期的2．5×10^6／mL提高为适应后的6．3×10^6／mL,目的蛋白活性也由适应前的2781U／mL提高为适应后的8878U／mL,适应后细胞的葡萄糖平均比消耗率为1．42μmol／（10^6细胞·d）,低于适应前的2．16μmol／（10^6细胞·d）。结论：贴壁生长的CHO细胞经过悬浮适应,不仅可以在悬浮培养条件下快速生长,而且细胞对葡萄糖的利用率也得到提高。     

造血干/祖细胞的体外扩增和临床应用

介绍造血干 / 祖细胞的体外培养和扩增取得的显著进展 :包括各种生物反应器的应用 ,三维培养系统的建立。扩增后的造血细胞在动物模型和临床上的应用已取得了初步成效。     

动物细胞无血清培养基及其应用

动物细胞无血清培养基及其应用陈昭烈,肖成祖（军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１）动物细胞无血清培养是当今生物科学领域中的重要研究课题之一。由于无血清培基可以是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培基。因而它不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具,而且为现代生物技术,尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。