动物细胞培养过程中的细胞自然凋亡

细胞培养过程中的细胞自然凋亡是细胞受环境压力的影响而发生的现象。随着细胞自然凋亡的分子生物学和生物化学研究的深入,对以动物细胞产品生产为目的的细胞培养产业将产生极有价值的影响。采用DNA重组技术把预防细胞自然凋亡的基因导入细胞和在培基中加入具有抗细胞自然凋亡的化合物等手段已用于预防或减缓细胞培养过程中的细胞自然凋亡。这些技术将大大延长细胞达到饱和密度后的培养时间,从而使细胞培养系统的生产效率得以显著提高。     

用YO-PRO-1和PI联合染色定量检测细胞凋亡

经不同浓度staurosporine处理诱导凋亡的G7细胞样品,分别用YO-PRO-1/PI和AV/PI进行荧光染色,借助流式细胞仪检测凋亡情况,将两种检测方法得到的结果进行统计学分析显示,二者有显著的相关性(r=0.9659,P<0.01),且没有显著性差异(P<0.05);另外,上述凋亡细胞样品经YO-PRO-1/PI染色后在荧光显微镜下计数凋亡细胞比例的结果与AV/PI流式细胞仪的检测结果也有显著的相关性(r=0.9903,P<0.01),且没有显著性差异(P<0.05)。以上这些结果表明,用YO-PRO-1/PI对细胞进行染色、借助流式细胞仪和荧光显微镜均能准确地检测细胞凋亡,可替代AV/PI流式细胞仪方法用于细胞凋亡的检测。     

诱导表达p27对HEK293细胞生长代谢的影响

目的：研究诱导表达p27对HEK293细胞生长和代谢的影响。方法：将pTet—on载体和响应于Dox的p27诱导表达载体共转染HEK293细胞,随机挑选单克隆细胞株。以细胞周期分布和活细胞密度为主要观察指标,考察稳定转染的细胞在Dox诱导下的细胞生长;以Qglc、Qlac和Qgln为主要观察指标,考察转染细胞在Dox诱导下的细胞代谢。结：p27基因的表达使HEK293细胞的增殖速度显著降低,G1期细胞比例显著升高,葡萄糖消耗和乳酸生产减少。结论：诱导表达p27基因是对HEK293细胞进行G1期阻滞的一种有效策略。     

hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系的建立

目的:建立组成型过量表达hTERT的Vero细胞系。方法:从质粒pCI-neo-hTERT酶切、分离纯化hTERT cDNA,克隆入phEF/chMAR-hyg载体中,构建重组真核表达质粒phEF/chMAR-hyg-hTERT。采用脂质体转染法转染Vero细胞,经潮霉素筛选、克隆分离培养,用RT-PCR检测转染阳性细胞克隆的hTERT mRNA表达丰度,Western blotting验证高丰度表达hTERT mRNA克隆的hTERT表达。用Cedex AS20细胞密度和活力分析系统考察过量表达hTERT Vero细胞在组织培养板中批次培养的生长特性。结果:从phEF/chMAR-hyg-hTERT转染阳性细胞中筛选出hTERT mRNA和蛋白高丰度表达的Vero细胞系(Vero-T1),Vero-T细胞在批次培养中后期的细胞密度和活力均高于野生型Vero细胞。结论:成功建立了hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系,为探索以组成型过量表达hTERT的技术途径改善细胞培养特性、提高病毒疫苗生产工艺水平奠定了基础。     

组成型过量表达hTERT对Vero细胞体外培养生物学特性的影响

目的：考察组成型过量表达人端粒酶催化亚单位（hTERT）对Vero细胞在无血清培养体系中的细胞形态、生长和代谢的影响。方法：以组成型过量表达hTERT的Vero细胞系T1为研究对象,以活细胞密度和细胞活力为主要观察指标,结合细胞形态和贴附伸展动态,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养和悬浮培养体系中的细胞生长;以葡萄糖比消耗速率（qglc）、乳酸比生成速率（qlac）、乳酸转化率（Ylac/glc）和谷氨酰胺比消耗率（qgin）为反映细胞代谢的主要观察指标,考察T1细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养的细胞代谢。结果：hTERT组成型过量表达在降低Vero细胞的贴附伸展能力和对血清的依赖程度的同时,提高了细胞无血清批次培养后期的细胞活力和活细胞密度,并赋予了T1非贴附依赖性生长的能力。hTERT组成型过量表达未对Vero细胞的代谢产生明显的影响。结论：hTERT组成型过量表达可降低Vero细胞的贴附生长依赖性和对血清的依赖程度,是有应用潜力的改良哺乳动物细胞体外培养性状的技术途径。     

造血干/祖细胞的体外扩增和临床应用

介绍造血干 / 祖细胞的体外培养和扩增取得的显著进展 :包括各种生物反应器的应用 ,三维培养系统的建立。扩增后的造血细胞在动物模型和临床上的应用已取得了初步成效。     

多孔微球固定化CHO工程细胞生产rt-PA的研究

以 Ｃｙｔｏｐｏｒｅ 多孔微球固定产重组组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔ Ｐ Ａ） Ｃ Ｈ Ｏ 工程细胞株４ Ｂ３ ,在２ Ｌ 搅拌式生物反应器用无血清培养基 Ｄ Ｆ５ Ｓ 连续灌流培养。４ Ｂ３ 细胞的最大活细胞密度和ｒｔ Ｐ Ａ 生产水平分别达到８８３ ×１０６／ ｍ Ｌ 和１２４７３ Ｉ Ｕ／ ｍ Ｌ。含ｒｔ Ｐ Ａ 的４ Ｂ３ 细胞培养上清经 Ｍ Ｐ Ｇ 吸附层析和 Ｌｙｓｉｎｅｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ 亲和层析两步纯化,ｒｔ Ｐ Ａ 的纯度达到９８ ％ 。     

动物细胞无血清培养基及其应用

动物细胞无血清培养基及其应用陈昭烈,肖成祖（军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１）动物细胞无血清培养是当今生物科学领域中的重要研究课题之一。由于无血清培基可以是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培基。因而它不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具,而且为现代生物技术,尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。     

乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位融合蛋白(S/preS1) 在CHO细胞中的稳定高效表达

含前S蛋白的重组乙型肝炎疫苗是第3代乙肝疫苗研发的重点,有望替代现在广泛使用的基因工程疫苗。构建表达乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位 (21-47位氨基酸) 融合蛋白 (S/preS1) 的真核表达载体HMRCHEF53u/Neo-S/preS1并转染CHO-S细胞,经ELISA和有限稀释克隆筛选获得了S/preS1表达效率高、体外培养生物学性状好的CHO细胞系10G6。Western blotting分析证实10G6表达的S/preS1同时保留S和preS1的天然免疫原性。10G6细胞在以活细胞密度和preS1/S浓度为评价指标的连续批次培养过程中保持着稳定的目的产物表达效率和良好的生长特性。采用无血清流加培养工艺,10G6细胞的活细胞密度和preS1/S浓度分别达到7×106～10×106 cells/mL和17～20 mg/L。     

以胶原膜为支架的心肌细胞体外三维培养

将从新生乳鼠心室肌组织获取的心肌细胞接种于鼠尾胶原膜三维支架和组织培养板,以细胞形态、细胞搏动、葡萄糖比消耗率(q_glu)、乳酸比产率(q_lac)、乳酸转化率(Y_lac/glu)、肌酸激酶及乳酸脱氢酶的活力为观察指标,比较心肌细胞在鼠尾胶原膜中三维(3D)培养和组织培养板中二维(2D)培养的差异。培养于鼠尾胶原膜的乳鼠心肌细胞在第5天形成闰盘连接,形成面积约为80mm³、肉眼可见自律性同步收缩的心肌细胞3D培养物。3D培养体系中乳鼠心肌细胞的q_glu、q_lac和Y_lac/glu的均值分别为7.37 μmol/10.6cells/d、2.92 μmol/106cells/d和0.38 μmol/μmol;2D培养体系中乳鼠心肌细胞的q_glu、q_lac和Y_lac/glu的均值分别为7.59 μmol/10.6cells/d、3.83 μmol/10.6cells/d和 0.51 μmol/μmol。两种培养体系中乳鼠心肌细胞的肌酸激酶及乳酸脱氢酶的活力无明显差别。实验结果表明：培养于鼠尾胶原膜的心肌细胞保持正常心肌细胞的代谢活力和收缩功能。