甲状旁腺激素和转铁蛋白N端半分子融合蛋白在毕赤酵母中的表达

用重叠PCR技术将PTH（parathyroid hormone, 甲状旁腺激素）基因与TFN（transferrin N_terminal half_molecule, 转铁蛋白N端半分子）基因在体外融合,融合基因克隆至真核表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母GS115。转化子经甲醇诱导后,融合蛋白得到了表达并分泌到发酵上清液中。经 SP Sepharose F F阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度大于95％的PTH_TFN样品。Western blot分析及腺苷酸环化酶实验证明融合蛋白中的PTH具有与抗PTH抗体结合能力及刺激腺苷酸环化酶的活性,铁饱和实验证明融合蛋白中的TFN和单独的TFN具有相同铁结合能力。因而TFN可望作为PTH的天然运输载体。     

人尿激酶型纤溶酶原激活因子截短型突变体与绿色荧光蛋白在真核细胞HEK293F中的融合表达

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)截短型突变体与绿色荧光蛋白(EGFP)分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达。方法:采用PCR法,分别以质粒pIRES2-EGFP和重组质粒pcDNA3.1(+)/uPA为模板,扩增出带BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的EGFP及带NheⅠ和HindⅢ酶切位点的uPA截短体基因片段,先后将EGFP和截短型uPA基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,转入HEK293F细胞,用G418对转染细胞进行加压筛选,通过共聚焦显微镜观察和ELISA方法鉴定表达产物。结果:DNA测序结果显示,uPA不同截短型突变体基因片段与EGFP基因融合的真核表达载体构建成功,共聚焦显微镜观察发现HEK293F细胞中有绿色荧光且定位于细胞质中,ELISA检测到HEK293F细胞培养上清中分泌型融合蛋白的表达。结论:构建了uPA截短型突变体与EGFP分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达,为后期研究uPA的相互作用蛋白及其生理功能奠定了基础。     

重组中国汉族人源γ-干扰素的纯化和鉴定

在E.coli中高表达的中国汉族人源γ-干扰素是以包涵体的形式存在的,包涵体经各种溶液洗涤后,用8 mol/L尿素裂解,裂解上清在8 mol/L尿素存在下,经离子交换柱层析和凝胶过滤两步纯化,得到纯度大于95%的γ-干扰素,稀释复性后,其比活为5.5×10⁵ U/mg. 激光解析电离质谱分析表明,中国汉族人源γ-干扰素的分子质量为17.32 ku,其N端序列与Gray等报道的γ-干扰素N端序列一致.中国汉族人源γ-干扰素的氨基酸组成分析结果也与其理论值相吻合.     

蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

目的:应用大肠杆菌表达系统表达纤溶性蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase。方法:运用PCR技术扩增人工合成的目的基因,引入Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切位点;目的基因经Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切后,克隆到pET22b载体上,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内表达,对获得的包涵体进行体外透析复性;应用纤维蛋白原水解法、纤维蛋白平板法和纤维蛋白层叠法检测复性后蛋白的降纤活性。结果:目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中获得高表达,复性后的蛋白具有降解纤维蛋白(原)的活性。结论:Alfimeprase包涵体可以通过复性获得活性产物。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。     

肽疫苗的研究进展

肽疫苗可分为3大类,即抗病毒相关肽疫苗、抗肿瘤相关肽疫苗、抗细菌及寄生虫感染的肽疫苗。肽疫苗具有安全、廉价、特异性强、易于保存和应用等特点。本主要介绍有关肽疫苗的设计、提高免疫原性及体内的稳定性、复合肽疫苗、临床评价等方面的研究和应用进展。     

AP-1辅助激活因子JAB1的分子克隆及其与肝细胞生成素的相互作用

利用酵母双杂交方法,用肝细胞生成素(HPO)作为诱饵蛋白在人胎肝cDNA文库中筛选到能与HPO相互作用的蛋白：AP-1辅助激活因子JAB1.并用PCR方法从人胎肝cDNA文库中扩出JAB1全长cDNA,进行GST-JAB1原核融合蛋白表达与纯化.蛋白质结合实验表明,JAB1与人重组HPO以及COS7真核表达的HPO在体外有结合作用.     

重组人血小板生成素融合蛋白工程菌发酵工艺的研究

对表达重组人血小板生成素融合蛋白（rhTPO/GST)工程菌的发酵条件进行了较详细的研究,优化了影响工程菌发酵的条件,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响。结果发现采用复合培养基分阶段流加有机营养物,用异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）进行诱导,使rhTPO/GST融合蛋白的湿菌重达25g/L以上,表达水平约占菌体总蛋白的30%左右。在此基础上,建立了中试发酵生产工艺流程。     

高GC含量DNA模板的PCR扩增

目的：探索高GC含量DNA的PCR扩增条件,为扩增达托霉素生物合成基因簇及拼接奠定基础。方法：在PCR扩增体系中,使用高保真的聚合酶及添加不同浓度的DMSO、7-deaza-dGTP等增强剂,并选择合适的PCR循环程序,优化富含GC的DNA的PCR扩增条件。结果：向反应体系中额外添加1%~4%的DMSO可以显著提高富含GC的DNA的PCR扩增产物量,但会降低其特异性;7-deaza-dGTP可以提高扩增产物的特异性及保真度,但产量会有所下降。应用touch down PCR并在体系中添加7-deaza-dGTP能够提高扩增产物的特异性和产率,增加扩增的保真度。结论：应用优化的PCR扩增条件将所有达托霉素生物合成基因簇分段扩增出来,并可扩增出长达6 kb的片段,且序列完全正确,可以进行后续拼接。     

福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因突变体的构建

目的：构建福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体,以进行后续ArgT功能研究。方法：根据福氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用λ-Red重组系统对argT基因进行缺失,并经PCR验证;采用定点突变的方法构建ArgT非降解株,并经SDS-PAGE验证;对野生株、argT缺失突变株和ArgT非降解突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：构建了2457T的argT缺失突变株和ArgT非降解突变株;2种突变株初始生长均较慢,但最终和野生株状态一致;2种突变株利用甘露醇的能力都比野生株强,而利用葡萄糖的能力降低。结论：获得了福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体。