人GM-CSF受体β链胞膜外区域与GM-CSF结合位点的研究

研究了抗人GM-CSF受体β链胞膜外区域4种人工合成多肽D1(9～114),D2(115～225),D3(226～325)和D4(326～422)4个多肽片段多克隆抗血清和McAb对GM-CSF生物学活性的阻断作用,结果首次发现抗D1多克隆抗血清和抗D1McAb 2A_9对 GM-CSF促进的 DMSO诱导的 HL60细胞、正常人胎儿骨髓细胞以及人GM-CSF依赖的TF-1细胞增殖有显著的阻断效应,抗D2McAb 1C₁₂对GM-CSF诱导的 TF-1细胞增殖也有显著的阻断效应,阻断抑制率均可达 90％以上,而其它抗受体 β链 McAb和无关对照 McAb E₇均无阻断活性.此结果表明:抗 D1 McAb2A₉和抗D2 McAb 1C₁₂所识别的表位则可能为受体β链与 GM-CSF的结合位点依据受体β链二级结构预测,受体与细胞因子结合部位的结构理论,设计和合成了受体β链45～75,56～75和 66～75 3个人工合成多肽片段,用间接ELISA结合试验分析表明,McAb 2A₉识别表位位于第 45～55位氨基酸内.应用受体与细胞因子结合部位的结构理论推测 McAb 1C₁₂识别表位可能位于β链内 216～220位氨基酸.此结果对于深入了解受体β链的结构与功能以及细胞因子与受体的相互作用均有十分重要的意义.     

降钙素基因相关肽的合成

降钙素基因相关肽是一个包含有37个氨基酸残基的具有较强降血压生理功能的活性多肽。我们采用常规的固相合成方法,以简单的装置最后经无水氟化氢处理,将肽从树脂上切下,同时脱除所有侧链保护基。粗产物在30％乙酸溶液中用碘作为氧化剂使二个半胱氨酸氧化,形成二硫键。合成的α-人降钙素基因相关肽经反向高效液相层析分离,获得在高效液相层析为单一峰的产物。经酸水解氨基酸分析证明与理论值相符并具有全部生理活性。     

含门冬酰胺肽类的镇痛活性与结构的关系

Asn-Ala-Gly-Ala四肽是从人脑分离出来的具有镇痛活性的多肽。为了阐明此活性肽生物活性的基本结构特征,曾合成了一系列的类似物并进行其活力测定。结果表明:该活性四肽的N-端三肽即Asn-Ala-Gly和活性四肽向C-端引伸一个Asn残基的五肽即Asn-Ala-Gly-Ala-AsnNH_2均有相似的镇痛活性,而第二位Ala为D-Ala取代的四肽类似物Asn-DAla-Gly-Ala亦具有相近的镇痛活力,然维持的时间较活性四肽为长。如N-端从Asn再延伸一个氨基酸残基或将活性四肽的顺序加以任何改变均导致镇痛活力的全部丧失。因此此活性四肽的基本结构为专一的四肽即Asn-Ala-Gly-Ala。由于此四肽的氨基酸顺序和人的β-LPH的第14位至18位顺序相同,曾猜测是否有可能β-LPH是此活性肽的前体。从合成牛的β-LPH14位至18位五肽即Glu-Ala-Pro-Ala-Glu不表现镇痛活力这点说明可能此活性肽并不与β-LPH有任何前体的关系。     

含门冬酰胺肽类的镇痛活性与结构的关系

Asn-Ala-Gly-Ala 四肽是从人脑分离出来的具有镇痛活性的多肽。为了阐明此活性肽生物活性的基本结构特征,曾合成了一系列的类似物并进行其活力测定。结果表明:该活性四肽的N-端三肽即Asn-Ala-Gly 和活性四肽向C-端引伸一个Asn 残基的五肽即Asn-Ala-Gly-Ala-AsnNH_2均有相似的镇痛活性,而第二位Ala 为D-Ala 取代的四肽类似物Ash-DAla-Gly-Ala 亦具有相近的镇痛活力,然维持的时间较活性四肽为长。如N-端从Asn 再延伸一个氨基酸残基或将活性四肽的顺序加以任何改变均导致镇痛活力的全部丧失。因此此活性四肽的基本结构为专一的四肽即Asn-Ala-Gly-Ala。由于此四肽的氨基酸顺序和人的β-LPH 的第14位至18位顺序相同,曾猜测是否有可能β-LPH 是此活性肽的前体。从合成牛的β-LPH14位至18位五肽即Glu-Ala-Pro-Ala-Glu 不表现镇痛活力这点说明可能此活性肽并不与β-LPH 有任何前体的关系。     

脑啡肽基因的合成——Ⅱ.d-GGAAACCA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链26核苷酸中八核苷酸片段d-GGAAACCA(10～17)的合成。合成系采用改良的三酯法,先合成和,再用对氯苯基磷酰二氯在1,2,4-三氮唑存在下磷酰化得到和,然后由bzAobz开始,依次同和缩合得到。在所有的缩合反应中,缩合剂均采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑。所得的全保护八核苷酸用浓氨水和80%醋酸脱去保护基后再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25(7M尿素)柱层析分离纯化并去盐后,即得到d-GGAAACCA。产物经5'-~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳-同系层析双向图谱能够得到预期的核苷酸排列顺序。     

脑啡肽基因的合成 Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)、d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBs)~(Bz)三个片段,然后由d-_(Dmt)A_?(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bz)脱去5′-Dmt基后依次同d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bz)T_(?OH)向5′端延伸缩合得到产物d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~BsT_?C_?~(An)C_?~(An)T_?A_?~(Bs)G_?~(ib)A_((OBs)_o)~(Bs) d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)是通过d-_(Dmt)G_?~(ib)A_(?OH)~(Bs)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_(?OH)~(An)分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3′-OH进行磷酰化得到。d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bs)则是由d-_(Dmt)A_?~(Bz)G_(?OH)~(ib)同d-A_(OBs)~(Bs)反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短往层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5′-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

降钙素基因相关肽和心房肽对犬冠脉的舒张作用

本实验利用冠脉内给药和离体血管灌流等方法观察比较了降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）和心房肽（ＡＮＰ）对犬冠脉循环的影响及其对犬大小冠状动脉的舒张作用。结果显示,ＣＧＲＰ和ＡＮＰ均能明显增加冠脉血流量、降低大小冠脉阻力,两者均呈剂量依赖性舒张大小脉冠脉血管。ＡＮＰ的作用显著小于ＣＧＲＰ,其中大冠脉对两者的反应性显著小于小冠脉,ＣＧＲＰ和ＡＮＰ对冠脉的舒张作用均无内皮依赖性。结果提示,ＣＧＲＰ和ＡＮＰ直接     

肿瘤坏死因子家族的新成员——TRANCE

肿瘤坏死因子相关激活诱导因子 (ＴＮＦ ｒｅｌａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅ ,ＴＲＡＮＣＥ)是肿瘤坏死因子家族的一个新成员 ,人ＴＲＡＮＣＥ基因首先由Ｗｏｎｇ等克隆 ,它是一种完整的Ⅱ型转膜糖蛋白 ,由 316个氨基酸组成 ,胞外区与同是ＴＮＦ家族成员的ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ和ＴＮＦ等有较高的同源性 ,ＴＲＡＮＣＥ表达的蛋白质是免疫系统、骨的发生和保持平衡的重要调节因子 .最近 ,Ｎａｇａｉ等通过 5′ ＲＡＣＥ法获得了分泌型的ＴＲＡＮＣＥ (ｓＴＲＡＮＣＥ ,ｓｅｃｒｅｔｅｄｆｏｒｍＴＲＡＮＣＥ…     

组织因子膜外区融合蛋白基因的表达及产物的分离纯化与活性分析

 为构建表达组织因子 (TF)膜外区的融合载体 ,制备组织因子膜外区 ,抽提人胎盘组织的总RNA,通过 RT- PCR法扩增出 TF的 c DNA克隆至 p UC1 8并测定全序列 .然后以此为模板 ,再次PCR扩增出 TF膜外区 (soluble TF,s TF) c DNA,并将其插入到谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX4T- 1 ,构建了 tac启动子控制下的 GST- s TF融合蛋白的表达载体 .表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切得到纯化的 s TF.表达产物经 ELISA验证 ,能特异性地与 TF抗体结合 .重新脂化后 ,该产物具有较大凝血活性 .以上说明采用融合蛋白表达系统可以大量制备组织因子膜外区 ,为研制国产重组凝血活酶试剂和研究 s TF的结构和功能创造条件 .     

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因的克隆与表达

用活性筛选法从产气单胞菌点状亚种ST7833 (Aeromonas puctata subsp.puctata ST7833)的基因组中克隆了脯氨酰内肽酶 (Prolyl Endopeptidase,简称apPEP)的基因,测定了含有PEP基因的33kb DNA片段的序列,第202092bp编码了690个氨基酸组成的脯氨酰内肽酶,经检索是一种新的PEP基因。并构建了一株组成性高效表达PEP的基因工程菌BL21/pGEMPEP。BL21/pGEMPEP在 YH培养基中apPEP的表达量占菌体总蛋白的30%左右,活力是野生菌的112倍,表达产物主要为可溶性的胞内蛋白,约5%分泌到胞外。非还原SDSPAGE显示为单体,分子量为76kD,与基因序列预测的分子量一致。试管培养后纯化得到了纯度大于90%的重组脯氨酰内肽酶,比活力为67U/mg。