按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究

为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1 gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1 gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示：①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7．5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Western blot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17％。上述结果表明：按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。     

猴痘、天花病毒感染快速分子诊断荧光定量实时PCR方法的建立

目的:天花、猴痘可感染人并引起严重皮疹、发热等临床症状,均为烈性传染病,是潜在的生物恐怖因子,因此需要建立针对其感染的快速特异的诊断方法。方法:分别设计正痘病毒属通用型、天花病毒特异、猴痘病毒特异的引物与荧光标记探针,建立荧光定量实时PCR方法,对人工合成或模拟样本进行检测。结果:可在4h内对天花或猴痘病毒感染进行特异性鉴别诊断,检测灵敏度可达100拷贝/25μL反应体积。结论:本方法可作为一种检疫与反恐应急储备技术。     

密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率影响的研究

为了研究密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率的影响,分别采用痘苗病毒及其宿主细胞的优势密码子对绿色荧光蛋白基因进行改造,利用荧光、Western blot和FCM等方法分析其在痘苗病毒载体系统的表达水平。结果显示,全部采用痘苗病毒优势密码子(富含A T)和全部采用宿主细胞优势密码子(富含G C),以及部分使用宿主细胞优势密码子的三种绿色荧光蛋白基因都能够有效表达,表达水平相近,表明痘苗病毒载体对目的基因密码子的使用具有很好宽容性。为了探讨这种宽容性的机理,分别利用在胞核内和在胞浆内转录的质粒载体对不同密码子偏性的绿色荧光蛋白基因进行表达分析。结果显示,胞核内转录目的基因的pcDNA3质粒载体能有效表达富含G C的绿色荧光蛋白基因,不能有效表达富含A T的绿色荧光蛋白基因,而胞浆内转录目的基因的pSCA质粒载体能同样有效表达上述不同密码子偏性的目的基因。这些结果表明,位于胞浆内的富含A U的转录产物能够有效表达,细胞核内生成的富含A U的转录产物可能受核膜屏障或其它核内因素影响而不能有效表达。因此,胞浆内繁殖的特性是痘苗病毒载体具有密码子宽容性的主要原因。此研究为痘苗病毒载体和常用真核表达载体的选择使用提供了重要实验依据。     

SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定

为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位,对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究。构建了分别表达SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E N蛋白的重组痘苗病毒,并制备了相应的小鼠免疫血清。用间接免疫荧光方法,检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应。与此同时,用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoV N蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性。免疫荧光检测结果表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达;3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应。Western blot结果显示,SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30~60aa、170~184aa、301~320aa和360~422aa;与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30~60aa、90~120aa、204~214aa和320~360aa;与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30~60aa、150~160aa和301~360aa。含SARS-CoV N蛋白特异表位的重组肽N155b(60~214aa)和N185(30~214aa)只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应,而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应。上述结果为使用SARS-CoV N蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究,提供了重要的实验依据。     

新型人冠状病毒HCoV—NL63和HCoV-HKU1的研究进展

多年来,人们公认的人冠状病毒包括HCoV-229E和HCoV-0C43等2株。但2002-2003年,由一种新型人冠状病毒SARS-CoV所引发的全球范围的严重急性呼吸综合征（SARS）的流行,使多国蒙受巨大损失,由此,冠状病毒又成为研究的焦点。随着分子生物学技术的发展,2004-2005年,又发现了2种新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1。在此,就这2种病毒的发现、流行情况,及其与疾病的相关性做一简要综述。     

三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究

In this study, three expression vectors encoding unmodified glycoproteins E1 and E2 from H77 (1a), Hebei (1b) and JFH1 (2a) strains were constructed to form pVRC-H77-E1E2, pVRC-HeBei-E1E2 and pVRC-JFH1-E1E2 expressing constructs. The protein expression was confirmed by immunofluorescene assay(IFA) and Western blot. The Lentiviral vector has the ability to package the cellular membrane into pseudo-particles. The plasmid expressing HCV E1-E2 glycoproteins in native form was co-transfected into 293FT cells with a lentiviral packaging plasmid (pHR'CMV delta R8.2)and a self-inactivated (SIN) transfer plasmid (pCS-CG) containing a reporter EGFP gene to produce infectious HCV pseudo-particles(pp). Flow cytometry assays showed that the HCVpp could infect Huh7 and Huh7-CD81, and the infectivity in Huh7-CD81 was about 2-3 times higher than that in Huh7 cells. Meanwhile, HCVpp could neither infect non-liver cells, for example, the 293 cells, nor HepG2 cell . Titration of HCVpp by p24 ELISA assay or infection assay showed that this HCVpp may contain 5-25 ng/mL p24 or 10(4)-10(5) TU (transducing unit)/ ml. An in vitro HCV neutralizing assays based on HCVpp (1a, 1b, 2a) were then established using AP33, a monoclone antibody with cross-neutralizing ability to different HCV strains. The neutralizing ability of the antibodies from HCV infected patients was further studied with this HCVpp system. In summary, three kinds of HCVpp (1a, 1b, 2a subtype) were successfully developed; In vitro HCV neutralizing assays based on HCVpp and SIN lentiviral system were established. This system paves a way for characterization of early steps of HCV infection (host tropisms, receptor binding, membrane fusion, et al. ) or screening anti-HCV drugs (such as inhibitor to virus entry). This system can be further applied to assess the human immune responses in HCV patients or evaluate HCV vaccine candidates.     

不同佐剂对人乳头瘤病毒16型L2E7E6蛋白免疫效果的影响

目的:研究CpG佐剂、弗氏佐剂、聚肌胞苷酸佐剂及左旋咪唑、西米替丁作为佐剂对人乳头瘤病毒16型L2E7E6融合蛋白在小鼠体内产生的免疫效果的影响。方法:以单独蛋白组、蛋白加各佐剂组分别肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,检测不同佐剂诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,并观察其对小鼠肿瘤生长的抑制作用。结果:各免疫组均能检测到高滴度的抗L2、E7、E6蛋白IgG抗体(以IgG1为主),其中弗氏佐剂能显著提高E6蛋白的IgG和IgG1抗体水平和E7蛋白的IgG1抗体水平(P<0.05),CpG佐剂明显提高了E7蛋白的IgG2a抗体水平(P<0.01);而西米替丁佐剂则降低了E7抗原的IgG抗体水平(P<0.05);同时可以检测到CpG佐剂组能诱发小鼠产生针对E7、E6较强的细胞免疫反应,且能抑制70%的荷瘤小鼠肿瘤生长;此外弗氏佐剂与聚肌胞苷酸佐剂可产生较弱的针对E7肽的细胞免疫反应,能延缓荷瘤小鼠肿瘤形成时间,与单纯蛋白组相比差异显著(P<0.05)。结论:CpG佐剂、弗氏佐剂和聚肌胞苷酸佐剂都能提高人乳头瘤病毒16型L2E7E6融合蛋白的细胞免疫反应水平和抑制肿瘤生长能力,其中CpG佐剂效果较好,为促进该蛋白作为疫苗的研发提供了实验依据。     

表达HIV-1六种基因的非复制型重组痘苗病毒在CEF细胞中遗传稳定

本研究目的是了解表达HIV-1六种基因的非复制型重组痘苗病毒(rNTV-C)的遗传稳定性(包括病毒载体和六种外源基因:gp160、gag、polr、evt、at和nef)。我们将rNTV-C在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代至25代,对第9、12、15以及25代病毒载体基因的稳定性、六种外源基因的稳定性、外源基因表达的稳定性以及外源基因的丢失率进行研究。结果显示:各代病毒均保持了非复制型天坛株痘苗病毒载体特点且传代稳定;HIV-1目的基因序列与原设计序列相符、重组位点正确且遗传稳定,连续传25代核苷酸突变率低于万分之一;目的蛋白在各代rNTV-C中均能有效表达,而且各代病毒之间表达量和分子量无明显差别;以Gag和Nef蛋白表达为标记,rNTV-C各代病毒的基因丢失率均在5%以下。本研究结果为疫苗生产提供了确保毒种稳定的关键资料。     

人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应

目的:在原核表达系统中表达人乳头瘤病毒11型(HPV11)L2NE7E6融合蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠,检测其诱发的T细胞免疫水平,并筛选HPV11 E6、E7特异的T细胞表位肽。方法:用重叠PCR方法构建HPV11L2NE7E6融合基因并插入原核表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达融合蛋白L2NE7E6,用SDS-PAGE和West-ern印迹鉴定融合蛋白的表达。Q柱纯化蛋白后免疫C57BL/6小鼠,分别用覆盖HPV11 E6和E7蛋白序列的肽库,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其诱发的E7、E6特异的T细胞免疫反应,并筛选E7、E6特异的T细胞表位肽。结果:在原核表达系统中有效表达了HPV11 L2NE7E6融合蛋白,蛋白纯化后免疫C57BL/6小鼠,分别能检测到针对HPV11 E6、E7肽库刺激产生的特异性T细胞免疫反应。经肽池筛选到1条强的E6 T细胞表位肽E6aa41-55(AEI-YAYAYKNLKVVW);而E7只筛选到2条弱的T细胞表位肽,分别为E7aa53-67(QILTCCCGCDSNVRL)和E7aa73-87(DGDIRQLQDLLLGTL)。结论:HPV11 L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生E6、E7特异性细胞免疫反应,可作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

医药生物技术前沿及其产业前景——我国病毒疫苗研发现状与进展

200多年来,疫苗研究取得了巨大发展。至今,仅用于人类疾病预防控制的疫苗就有30多种。中国是疫苗生产大国,多数人用疫苗均能自主生产。疫苗的广泛应用在预防和控制严重危害人类健康疾病方面发挥了重要作用。然而,至今仍有许多重要疫苗未能研制成功,特别是一些严重危害人类健康的病毒的疫苗需要加大研发力度;