林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶活力调节的研究

对不同氮源生长条件下林肯链霉菌无细胞粗提液中谷氨酰胺合成酶 (GS)的研究结果表明 ,高浓度NH+4阻遏了GS的生物合成。从不同氮源生长条件下林肯链霉菌中分离纯化了GS ,其性质没有差别。以受腺苷化调节的产气克雷伯氏菌GS作对照 ,林肯链霉菌GS没有明显的氨休克作用 ,经蛇毒磷酸二酯酶处理后 ,其活力没有变化。这些结果都说明林肯链霉菌GS不存在腺苷化共价修饰这一调节方式。反馈抑制作用是林肯链霉菌GS的一种重要的调节方式 ,这种抑制作用是以累积的方式进行的 ,这表明各种抑制剂对GS作用位点不同 ,各种抑制剂对GS的抑制作用是相互独立的。由此推测 ,林肯链霉菌GS是一种变构酶。     

提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

三角酵母(Trigonopsis variabilis)的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO,EC1.4.3.3)是一种胞内酶,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)等理化因子的透性化效率,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。30%～35%丙酮浓度,4～28℃保温,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短,在5min内即可完成。同时,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(Cephalosporin C, CPC)为戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-ACA,GL-7ACA)。     

头状轮生链霉菌中丝裂霉素C抗性基因的克隆及功能研究

头状轮生链霉菌(\%Streptoverticillium caespitosus\%)ATCC27422是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌,实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素C敏感的阻断变种S6,并以它为受体宿主,以质粒pIJ699为载体,建立野生型头状轮生链霉菌菌株ATCC27422的基因库。采用鸟枪法克隆技术,从库中筛选获得含有丝裂霉素C抗性基因的62kb外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒pLX5导入变铅青链霉菌(\%Streptomyces lividans\%)获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将pLX5导入野生型菌株中,使其对丝裂霉素C的抗性大幅度提高：最低抑制浓度(MIC)由原来的200μg/mL上升至1000μg/mL以上。摇瓶发酵实验表明：单位菌量的ATCC27422(pLX5)的丝裂霉素产量高于野生菌株ATCC27422,因此丝裂霉素C抗性与产量之间存在一定的相关性。     

改造α乳清蛋白的定点突变研究

蛋白质结构与功能之间关系的研究一直是生命科学领域的焦点 .采用定点诱变技术在克隆 c DNA的预定位点导入突变 ,然后在适当的宿主细胞 -载体系统中表达已改变的基因 ,通过比较突变体蛋白与野生型蛋白的性质 ,往往可能鉴别出对蛋白质的结构完整性和生物学功能至关重要的结构域或氨基酸残基 [1,2 ] .α乳清蛋白是哺乳动物乳汁中的主要蛋白质 ,它和半乳糖苷转移酶一起形成复合物 ,称为乳糖合成酶 .C型溶菌酶的功能是催化裂解细菌细胞壁肽聚糖组分 NAM- NAG的 β- 1 ,4糖苷键 .早期的研究发现 ,虽然它们是两种功能截然不同的蛋白质 ,它们自…     

安普霉素的生物合成:辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源

安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素,其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元.迄今为止,尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道.研究发现,向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象,表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成.[2-13C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明,甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基.同时发现,菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比,但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成.据报道,甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素,如对rapamycin的生物合成中转甲基过程有抑制作用.由此推测,尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用,甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基.此外,[2-13C,15N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH2的合成.     

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediteranei)U-32硝酸还原酶的定位、纯化及性质

在力复霉素ＳＶ研究中,发现硝酸盐对抗生素合成呈现多效性作用,不仅大幅度提高产量,还对产生菌——地中海拟无枝菌酸菌生理产生多方面的影响,从而提出整体性调节的结论．这一多效性作用是由硝酸盐所引起的,为此对硝酸还原酶进行了研究．首先,通过原生质体渗透裂解发现地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２的硝酸还原酶是一个胞质酶．该酶极不稳定,缓冲液中加入硝酸钾、甘油等保护剂能极大地提高其稳定性．通过硫酸鱼精蛋白沉淀,硫酸铵分级分离,Ｐｈｅｎｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、Ｂｉｏ－ＧｅｌＡ１．５ｍＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析等多步纯化得到了电泳纯的硝酸还原酶．该酶为一７９ｋＤ的单亚基酶,每分子酶含有约２．２９原子的钼,但并不含有非血红素铁、酸不稳定硫、ＦＭＮ及ＦＡＤ,其等电点为６．２,反应最适ｐＨ为７．２,最适温度为４０℃．对硝酸根的Ｋｍ值为１３．３μｍｏｌ／Ｌ．同时分析了该酶的吸收光谱．     

高丁醇比丙酮丁醇梭菌的选育与应用

设计了专一性分离方法,从土样中分离了多株能产生溶剂的梭苗,经多次单细胞分离、纯化,再经亚硝基胍和甲基磺酸乙酯诱变和抗性筛选,获得几株高丁醇的丙酮丁醇梭菌。对高产菌株的性状稳定性、发酵过程、混合原料应用、温度的影响进行了研究。结果证明菌株性状稳定,丁醇产量为总溶剂的７０％;过程为典型的丙酮丁醇发酵,对温度可耐受到３９－４０℃;能利用玉米和薯干,玉米和高梁进行正常发酵。菌株已在百吨生产罐,连续应用一年     

地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆

Southern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌U-32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的PstⅠ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体上一个相同的PstⅠ片段杂交,位于这一片段上的2.1kb SmaⅠ-EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5.0kb PstⅠDNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-32的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1.5kb左右,进一步的杂交分析发现在5.0kb的PstⅠ片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJL1进行了限制酶酶谱的构建,发现有10种酶在pJL1外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoRⅠ与SmaⅠ各有两个切点。