6株O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来.克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.8%～100%之间.T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86.1%～95.8%之间;发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性.故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDV O型中国拓朴型(Cathaytopotype).     

人红细胞生成素基因在小鼠体内的转移与表达

将人的红细胞生成素(EPO)基因克隆在CMV启动子的下游,构建EPO表达质粒,在BHK₂₁细胞中表达成功后,将该质粒经脂质体包埋,再导入到小鼠的骨骼肌内,在体内亦获得了表达,一个月时小鼠血浆中人红细胞生成素的表达量高达1 340 ng/L,这为贫血病人的基因治疗提供了科学依据.     

外源硅对连作基质浸提液抑制黄瓜种子萌发的缓解效应

该试验以‘新春4号’黄瓜为试材,研究在连作基质浸提液(基质∶水=1∶6)处理下,外源添加4 mmol·L~(-1) Na_2SiO_3·9H_2O对黄瓜种子萌发、膜脂过氧化、抗氧化酶活性及淀粉转化的影响,以揭示外源硅对连作基质浸提液抑制黄瓜种子萌发的缓解效应及其生理生化机制,为生产中解决黄瓜基质栽培连作障碍问题提供理论依据。结果显示:(1)连作基质浸提液处理显著抑制了黄瓜种子的萌发,使得丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量升高,抗氧化酶活性和淀粉水解酶活性降低,淀粉含量升高而可溶性糖含量降低,同时AMY和BMY基因的表达水平显著下调。(2)添加外源硅处理后,可有效缓解连作基质浸提液对黄瓜种子萌发生长的抑制,降低MDA和Pro含量,提高抗氧化酶和淀粉水解酶活性,且提高了可溶性糖含量,AMY和BMY基因表达水平上调。研究表明,1∶6浓度的连作基质浸提液可显著抑制黄瓜种子萌发,使淀粉转化受阻,基因表达水平下调;外源添加4 mmol·L~(-1) Na_2SiO_3·9H_2O可提高受胁迫黄瓜种子芽苗中淀粉的转化速率,维护黄瓜种子萌发的正常生理功能,进而缓解连作基质浸提液对黄瓜种子萌发造成的伤害。     

共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究

用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照.免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况.免疫后不同时间分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数.试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑制抗体（HI）;共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA.重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d进行攻毒实验,rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达10/10,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达9/10,与常规疫苗相当.免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况.结果表明,rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒.rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重的影响.     

HIV-1结构蛋白gag-gp120与白细胞介素2联合基因免疫

在真核表达载体pVAX1中的CMV启动子下游插入IL-2基因,构建真核表达质粒pVAXIL2。将它与表达I型人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus1,HIV-1)gag-gp120的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌肉注射BALB/c小鼠,免疫3次后,以ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HIV-1抗体水平,结果显示联合免疫组小鼠在免疫2周后已有抗体产生,6周后进入高峰。乳酸脱氢酶释放法检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性,结果显示联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性显著高于pVAXGE单独免疫组(P<0.05)和载体质粒pVAX1对照组(P<0.01)。以上结果表明:HIV-1核酸疫苗质粒pVAXGE与真核表达质粒pVAXIL2联合免疫可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答,且免疫应答水平高于pVAXGE单独免疫组,IL-2发挥了免疫佐剂的作用,增强了核酸疫苗的免疫原性。     

表达中国流行株HIV-1 gp120外膜蛋白靶细胞模型的建立

利用pDispaly真核表达载体构建了用于表达中国流行株HIV-1 gp120的真核表达质粒pD-120,通过脂质体转染法将其导入人宫颈癌细胞（HeLa）,经G418反复加压筛选,直到细胞不再死亡为止,8代后获得稳定表达中国流行株HIV-1gp120蛋白的靶细胞复制模型HeLa-gp,SDS-PAGE、蛋白印迹与间接免疫荧光分析表明,重组蛋白得到很好表达,并具有良好生物活性。本研究为抗AIDS/HIV治疗用基因工程制剂或靶向药物的活性检测奠定了坚实基础。     

pVVP3和pVHN核酸疫苗的构建、表达及对肿瘤细胞的作用

用pVAX1载体构建抗肿瘤核酸疫苗 .将鸡贫血病病毒 (CAV)的VP3基因和鸡新城疫病毒(NDV)HN基因插入载体pVAX1的多克隆位点 ,构建了 2个重组基因疫苗pVVP3和pVHN .转染OS732细胞 ,Western印迹及血凝试验检测HN基因表达状况及表达产物的活性 .RT PCR、DNALadder、TUNNEL染色检测VP3基因的表达及表达产物诱导OS732细胞凋亡作用 .酶切鉴定证实成功地构建了两个核酸疫苗 ,并能在真核细胞内表达 .含HN的核酸疫苗pVHN表达后具有血凝活性并致肿瘤细胞表面唾液酸含量降低 (P <0 0 5 ) .pVVP3的转染能导致OS732细胞凋亡 ,凋亡率可达87% .试验结果表明 ,pVVP3和pVHN两个核酸疫苗体外应用后能诱导肿瘤细胞凋亡并显著降低肿瘤细胞表面唾液酸含量     

人源性基因calsenilin/KChIP3/DREAM的单克隆抗体的制备及鉴定

Calsenilin/KChIP3/DREAM, 是脑中高表达蛋白,最初发现是因其与presenilin 和钙离子结合而得名。作为转录因子抑制因子,该基因在细胞核内具有多种功能。该基因在钙离子作用下细胞核内常常与c-fos、prodynorphin等基因的启动子下游的特异性DRE位点相结合,调节这些基因的表达。另一方面,作为钾离子通道结合蛋白,该基因具有4种isoforms,其中KChIP1广泛存在于各种组织中而KChIP2只在心脏中特异表达,KChIP3和 KChIP4则在脑中显示较高的表达。4种基因在C-端结构非常相象,N-端则显示多样性。除此之外,和许多基因相似,calsenilin经PKC、CKI、PKA等激酶作用可产生多位点的磷酸化,其中主要位点Ser63的磷酸化可以阻止caspase-3对该基因的降解作用。另一方面,Calsenilin作为转录因子激动因子结合于维生素D和视黄酸效应因子启动子上游促进转录的进行。 到目前为止,Calsenilin/KChIP3/DREAM在细胞核内具有双重基因表达调控作用,即当结合于启动子上游时显示正调控而当结合在启动子下游时显示负调控。为了更加深入研究calsenilin的功能及寻找新的受其调控的基因,首先制备可特异性识别的单克隆抗体。利用RT-PCR 技术,从人脑中提取RNA扩增calsenilin全基因,克隆于pGEX-4T-2原核细胞表达载体中,经IPTG诱导表达、Gluthathion Sepharose 4B纯化得到GST-calsenilin/DREAM/KChIP3重组蛋白,并免疫小鼠。通过PEG细胞融合得到单克隆抗体。经细胞免疫染色及Western blotting检测显示说明本实验得到单克隆抗体可以用来进行细胞免疫染色及Western blotting等检测。该抗体的成功制备,为今后对calsenilin/DREAM/KChIP3调控基因表达的更深入研究提供了有效工具,也填补了国内尚无该基因单克隆抗体资源的空白。     

口蹄疫病毒O/NY00株基因组L片段的克隆及其基因特征

采用RT—PCR方法对口蹄疫病毒O／NY00株基因组L片段进行了分子克隆和序列测定。结果表明：获得的O／NY00株基因组L片段长7805nt,其中包括715nt的5’非编码区和6999nt的多聚蛋白编码区。将O／NY00株与其它参考毒株进行序列比较,结果显示：O／NY00株与O／SKR／2000、O／1JKG／3／2001遗传关系最近,而与其它毒株遗传关系较远,属于0型口蹄疫ME-SA拓扑型Pan／ksia株的成员。与Cathay拓扑型的代表毒株O／TAW／97比较,两者在主要抗原位点1和位点3呈现出明显的以拓扑型为特征的氨基酸差别,提示两拓扑型毒株之间有较高的抗原差异。     

新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证

目的: 构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,并对其功能进行验证。方法: 设计一个包含人巨细胞病毒启动子(CMV promoter)、T7启动子、信号肽基因、血凝素A表位基因(HA)、多克隆位点区域(MCS)、c-myc抗原表位、血小板来源的生长因子受体跨膜区域(PDGFR TM)及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH polyA)等八种元素的表达盒Ⅱ(Expressing cassette Ⅱ),在其上下游添加Nru Ⅰ酶切位点后,进行人工化学合成,连接到克隆载体pGH中得pGH-Ⅱ;用Nru Ⅰ酶切pGH-Ⅱ,回收1 300bp左右的片段,去磷后插入到pVAX1的相应位点,Nru Ⅰ及Bgl Ⅱ/Pst Ⅰ酶切鉴定,获得新型基因疫苗真核表达载体pVAX2;然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将其分别构建至两个不同的表达盒内,脂质体转染BHK-21细胞,利用RT-PCR及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证。结果: 两个表达盒内的EGFP基因在BHK-21细胞均能高效表达,相互间不受影响,且新构建的表达盒具有蛋白展示功能。结论: 成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,为多价DNA疫苗的研究奠定了坚实基础。