NADC30-like猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的制备与鉴定

【背景】猪繁殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可以造成怀孕母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病,近年来,NADC30-like谱系PRRSV已成为国内的优势流行毒株。【目的】研制针对NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。【方法】将PRRSV NADC30-like毒株编码GP5蛋白开放阅读框5(open reading frame 5,ORF5)、ORF6(编码M蛋白)分别连接至pFastBac^TMDual载体P₁₀和P_H启动子下游多克隆位点,获得穿梭质粒pFB-30-ORF5及pFB-30-ORF6,酶切鉴定后,将ORF6基因插入到穿梭质粒pFB-30-ORF5 P_H启动子下游,构建穿梭质粒pFB-30-ORF5-OPF6。将上述3种穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选及PCR鉴定重组杆粒。再将获得的重组杆粒转染至SF9昆虫细胞,发现细胞病变后收获病毒液,继续盲传3代,在透射电镜下观察是否有病毒样颗粒。用第3代病毒液感染SF9细胞后,分别用GP5蛋白、His-tag、Flag-tag单克隆抗体作为一抗,通过免疫电镜、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、Western blotting鉴定重组蛋白。【结果】成功构建了3种穿梭质粒pFB-30-ORF5、pFB-30-ORF6和pFB-30-ORF5-OPF6,酶切鉴定正确。通过蓝白斑筛选及PCR验证后获得重组杆粒,分别命名为Bacmind-30-ORF5、Bacmind-30-ORF6和Bacmind-30-ORF5-ORF6。重组杆粒感染SF9细胞120h时出现明显的细胞病变,收获病毒液后,在透射电子显微镜可观察到大小为50nm左右呈现球形结构的VLPs。免疫电镜可以观察到胶体金颗粒结合在VLPs周围;IFA结果显示实验组均出现了明显绿色的特异性荧光灶;Western blotting结果表明,3种VLPs均出现特异性条带,并与预期大小一致。【结论】制备了3种NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒,为针对PRRSV新谱系流行株疫苗的研发奠定了基础。