重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72～ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。     

以葡萄糖为生长相基质的重组毕赤酵母表达植酸酶发酵

甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白是在醇氧化酶（alcohol oxidase,AOX）启动子（PAOXI）严格调控下进行的,然而这种启动子在转录水平受到葡萄糖的阻遏。本文研究了毕赤酵母在葡萄糖替代甘油为生长相碳源时表达重组植酸酶蛋白的发酵特征。结果表明：初始葡萄糖浓度为20dL的细胞得率高,为0．39g[DCW]／g。通过基于实时参数（溶氧和呼吸商）调控的葡萄糖补料策略,生长相40h后细胞密度达到100g[DCW]／L,甲醇诱导100h后植酸酶产量达到2200FTUphytase／mL,甲醇得率系数为0．25FTU phytase／gmethnol。因此,在毕赤酵母高表达重组蛋白培养中葡萄糖能够用作生长相基质,并能实现重组蛋白的高效表达。     

毕赤氏酵母工程菌高密度发酵表达恶性疟原虫融合抗原的研究

疟疾目前仍是危害人类健康的主要传染病,现全球每年新增疟疾病例3～5亿人,其中约300万人死于该病.特别是病原虫抗药性的产生和扩散已给疟疾防治工作带来极大困难,因此研制新的预防措施已成为当务之急.研制有效的疟疾疫苗被认为是人类控制乃至消灭疟疾的重要途径,已越来越受到重视,并已构建和鉴定多个疫苗候选抗原[1,2].本研究进行高密度优化表达的融合抗原就是一个疫苗候选抗原.     

pH控制下绿色木霉（Trichoderma viride）流加发酵生产纤维素酶

绿色木霉（Trichodermaviride）在pH控制发酵条件下,采用流加葡萄糖发酵策略,可显著提高综合滤纸酶活力（FPA）和内切酶（endo—β—1,4-glucanase,EG）、外切酶exo—β-1,4-glucanase,CBH）、纤维二糖酶（cellobiase,CB）酶活。在5L发酵罐中采用pH控制和流加葡萄糖工艺,可提高CB酶含量,改变酶组分之间的比例,使得FPA、EG、CB和CBH酶活分别达到50．0U／mL,210．0U／mL,4．0U／mL和2．5U／mL,比摇瓶发酵分别提高了6．7．4．2、19、2．5倍。     

两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究

通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD600达150,蛋白表达量4.8g·L-1,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度培养条件研究*

基因工程菌pichiapastoris最佳种子培养基为添加 4mL/LPTMl的BMGY培养基 ;全合成高密度摇瓶培养基是甘油 4% ,(NH₄) ₂ SO₄1 0g/L ,CaSO₄0 .93g/L ,K₂ SO₄1 8.2g/L ,MgSO₄·7H₂O 1 4.9g/L ,0 1mol/L磷酸缓冲液 (pH =6     

两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究*

通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD₆₀₀达150,蛋白表达量4.8g·L^-1,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。     

pH值对绿色木霉(Trichoderma viride)产纤维素酶的影响

采用微晶纤维素为唯一诱导性碳源,对绿色木霉(Trichoderma viride)在摇瓶发酵过程中控制与不控制pH产纤维素酶进行比较.控制pH时胞外蛋白浓度为0.72 mg/mL比不控制pH时提高43%;FPA、EG、GB和CBH酶活为15.0U/mL,120.0U/mL,1.75U/mL,0.85U/mL分别是不控制pH时的2.1、2.3、11.7和1.7倍.在不同pH下测定纤维素酶液各酶活,表明pH值显著影响纤维素酶各单酶酶活.在pH2.7时,β-葡萄糖苷酶酶活仅为pH4.8时酶活的4%;pH回调试验结果表明β-葡萄糖苷酶对pH敏感,并在催化功能上发生不可逆变化.对纤维素酶液添加分离得到的各单酶,当添加β-葡萄糖苷酶时最多可以提高FPA酶活20%.因此β-葡萄糖苷酶是影响综合酶活的关键酶.通过拉曼光谱检测出β-葡萄糖苷酶在pH5.0有活性状态下,酶蛋白主链结构主要为a-螺旋和无规则卷曲;在pH2.0没有活性状态下,酶蛋白主链结构的无规则卷曲发生较大变化,a-螺旋也受到一定影响.这说明pH对β-葡萄糖苷酶构象的改变是造成其活性变化的主要原因.     

龟裂链霉菌RsigB基因提高大肠杆菌对环境胁迫的耐受性

龟裂链霉菌RsigB是与天蓝色链霉菌与枯草芽孢杆菌中的sigmaB基因同源的一个σ因子,其也可能为一种全局压力调控蛋白,在菌体遇到生长环境改变时起着重要的调控作用。本文以龟裂链霉菌基因组为模版,PCR扩增出RsigB基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28aRsigB,并且转化至Escherichia coli BL21(DE3)中。将对照菌与重组子置于不同环境胁迫条件下培养,并用IPTG诱导蛋白表达,测其生长曲线,研究RsigB对于大肠杆菌对环境胁迫的耐受性的作用。结果表明,RsigB在大肠杆菌中的表达能够提高其对温度,高渗透压以及氧化还原压力的耐受性。RsigB的成功表达以及对于逆境的耐受性能为龟裂链霉菌中RsigB因子的功能以及机理研究提供实验基础。