HIF-1α的可逆性SUMO化修饰

低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)是参与调节机体氧平衡的重要转录因子,在细胞低氧应答反应中起核心作用,能调节100多种涉及低氧应激下细胞适应和存活的靶基因．HIF-1由氧敏感的α亚基和在细胞内稳定表达的β亚基组成．其中α亚基可受到多种翻译后化学修饰作用,如在常氧下,HIF-1α通过泛素化蛋白酶修饰并导致其快速降解．最近几年发现的泛素样蛋白家族成员小泛素蛋白样修饰蛋白（SUMO）也能与HIF-1α共价结合．SUMO是一种分子量约为12 kD的小蛋白,从拟南芥到人类普遍存在．SUMO可共价结合许多靶底物蛋白,并对其进行翻译后修饰,该过程称为SUMO化．与泛素化蛋白酶体途径不同的是,SUMO化修饰能在常氧和相对低氧的条件下调节HIF-1α蛋白的稳定性,从而改变其转录活性．SUMO化是一个可逆的动态过程,可被特异性蛋白酶ULP/SENP将其从底物上去除．本文主要就HIF-1α的可逆性SUMO化修饰作一综述．     

MEK1/2抑制剂U0126抑制肠道病毒71型的复制

为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础.     

扣针蛋白-5与疾病

扣针蛋白-5(fibulin-5,FBLN-5)是一个胞外基质糖蛋白,广泛分布于富含弹性蛋白的组织中,可通过与其它胞外蛋白相互作用而调节基质的结构.近期研究发现,该蛋白是一个内源性的血管生成抑制剂,在血管发育中发挥了重要的作用.同时,扣针蛋白-5与一些肿瘤的增殖、转移和侵袭等相关,其基因突变则会导致遗传性疾病的发生.本文就扣针蛋白-5与血管生成、血管发育、肿瘤及遗传性疾病的关系及当前的研究进展进行综述.     

重组福安泰-03抑制人脐静脉血管内皮细胞的迁移和增殖

研究重组福安泰-03(recombinant Fuantai-03,rFAT-03)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移和增殖的影响.聚碳酸酯膜小室趋化运动模型(transwell model)检测rFAT-03对HUVECs迁移能力的影响;MTT法检测rFAT-03对HUVECs和多种人癌细胞生长的影响;荧光显微镜观察rFAT-03作用下HUVECs的形态变化;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,annexinV-FITC)双染检测rFAT-03对HUVECs早期凋亡的影响;流式细胞术分析rFAT-03对HUVECs周期及凋亡的影响;Western印迹检查rFAT-03对HUVECs血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Bax和Bcl-2表达的影响.结果显示,rFAT-03明显抑制HUVECs细胞的迁移和增殖,其抑制效果与剂量和作用时间相关.0.20mg/mL恩度(endostar),0.10、0.20mg/mLrFAT-03作用HUVECs24h,对细胞迁移的抑制率分别为32.0%、32.6%、57.1%(P0.01).0.20mg/mL恩度,0.05、0.10、0.20mg/mLrFAT-03作用HUVECs72h,其对细胞生长的抑制率分别为40.9%、63.7%、69.3%、87.0%.但rFAT-03对多种人癌细胞株的生长却无明显影响.rFAT-03处理HUVECs24h,细胞的早期凋亡率增加(P0.05).rFAT-03阻滞HUVECs于G0/G1期,并呈现典型的凋亡峰.终浓度为0.05、0.10、0.20mg/mLrFAT-03作用于HUVECs24h,G0/G1期细胞指数分别为63.4%、67.5%和75.7%(对照组为62.1%),凋亡指数分别为4.2%、8.5%和10.3%.rFAT-03下调HUVECs的VEGF和抑调亡基因Bcl-2的表达,上调促凋亡基因Bax的表达,其效果与剂量相关.结果提示,rFAT-03明显抑制HUVECs细胞的迁移和增殖,诱导其凋亡,它的这些作用与其下调VEGF、Bcl-2表达,上调Bax表达密切相关.     

聚乙二醇伴随式离子交换层析分离重组乙肝病毒表面抗原

对由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的多聚亚基蛋白HBsAg在离子交换层析过程中容易因亚基解离而导致蛋白解聚和丧失生物活性的难题,实验中选择聚乙二醇（PEG）作为保护剂伴随式（Polyethylene Glycol-Accompanied）离子交换层析分离纯化HBsAg。实验表明,在流动相中加入1% PEG10000(W/V)作为纯化伴侣, HBsAg的回收率由55% 左右提高到80%以上,纯化倍数基本保持在12左右。对纯化产物进行SDS_PAGE分析表明,1% PEG10000的纯化伴侣伴随式离子交换层析能全部保留HBsAg的糖基化蛋白单体（27kD和30kD）,高效液相色谱联用多角度激光散射(High Performance Size Exclusion Chromatography_Multiangle Laser Light Scattering, HPSEC-MALLS )进一步分析阐明了PEG能促使HBsAg颗粒尺寸分布更均一,结构更接近天然乙肝表面抗原。     

江豚腰尾神经的解剖学研究

江豚脊神经式：Ｃ８Ｔ１３Ｌｃ２３。脊神经腹根较背根粗;腰尾神经根入入脊髓时呈内、外侧两束或单束连于脊神经节。背支与腹支分别分布于水平隔上方和下方。背支中的肌支分布至升尾肌（背棘肌、背最长肌、髂肋肌和尾上肌）。腹支在椎体两侧横突间,分支数目少于背支,其肌支分布至降尾肌（尾下肌、轴下肌和坐导肌）。Ｌｃ７￣Ｌｃ１０神经腹支形成异常粗大的外阴神经,并有掌状分支至坐尾肌;Ｌｃ１０￣Ｌｃ２０神经腹支在脊柱腹面     

人hIL-24Δ103重组腺病毒感染诱导A549细胞凋亡

白细胞介素24（interleukin 24,IL-24）是近年来新发现的1个IL-10家族细胞因子,具有明显的抗肿瘤活性．为了研究开发高活性、低分子量的IL-24,并探讨其用于肿瘤靶向治疗的可能性,本研究在前期基础上,进一步构建并制备了缺失N端103个氨基酸残基的IL-24（hIL-24Δ103）重组腺病毒,并观察了其对A549细胞生长增殖和凋亡的影响．首先,采用PCR技术扩增IL-24第104位至第206位氨基酸区域的编码序列,制备hIL-24Δ103重组腺病毒．用Ad-hIL-24Δ103重组腺病毒感染肺癌A549细胞. MTT分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染显著抑制了A549细胞的生长．Hoechst 33258染色和流式细胞仪分析结果表明,Ad-hIL 24Δ103感染导致细胞凋亡．Western 印迹分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染导致了PKR和eIF-2α蛋白的表达上调与磷酸化激活,提示PKR和eIF-2α参与了hIL-24Δ103导致的细胞生长抑制和细胞凋亡过程的调节．关键词 人白介素24;腺病毒;细胞增殖;细胞凋亡     

水泡性口炎病毒核蛋白基因的表达及初步应用

将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建N基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经PCR限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得N基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了水泡性口炎病毒N基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白抗原。SDS-PAGE、Western blotting及间接ELISA试验结果表明,表达蛋白为融合蛋白,质量约63.5 kD,其表达产量约占菌体总蛋白的16％,相当于92mg/L。融合蛋白中含有水泡性口炎病毒群特异性的核蛋白抗原,应用表达的VSV核蛋白抗原建立了酶联免疫吸附试验,通过对186份山羊、豚鼠实验动物人工感染VSV的血清样品和参考血清样品的检测,并与微量血清中和试验进行了比较,结果表明：以表达的VSV核蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验是一种特异性强、敏感性高、快速、简单、安全的检测方法,抗原制备成本低。     

基于SYBR Green I的双链DNA定量方法

摘要 基于SYBR Green I荧光染料与双链DNA（dsDNA）结合产生荧光的原理,建立一种高精度、高通量的双链DNA 定量方法。将梯度稀释后的基因组DNA及已知浓度的?DNA与等体积的SYBR Green I（4×）充分混合后,利用荧光定量PCR仪采集荧光信号,以ROX（1×）作为校正染料进行定量分析;同时利用紫外分光光度计对样品进行平行测定,比较该方法与紫外分光光度法的检测限与准确度。紫外分光光度法的检测限为2 ng/?l,而SYBR Green I荧光定量法的检测限可达到0.015 ng/?l,并且在0.015~2 ng/?l范围内,SYBR Green I荧光强度与?DNA浓度呈线性关系（R2=0.9999）,比紫外分光光度法灵敏100倍以上,并可准确定量低纯度的DNA样品。此方法具有重复性好、高通量的特点,仅需少量的生物样本即可满足定量要求,为分子生物学研究及临床检验等多个领域提供了一种可靠的dsDNA定量方法。     

miRNA-155对氟虫腈作用下斑马鱼ZF4细胞存活的影响

microRNA（miRNA）是一类长约20～24 nt的非编码单链小分子RNA. 环境毒理学研究表明,当生物暴露于环境化学物质时,会引起相关miRNA表达发生变化,进而调节基因的表达. 农药氟虫腈是一种苯基吡唑类杀虫剂,能影响斑马鱼中miR-155的正常表达,但尚未见异位表达的miR-155对斑马鱼细胞影响的研究. 本研究明确了异位表达的miR-155对氟虫腈作用下斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响. 结果显示,氟虫腈处理ZF4细胞72 h的IC50值为39.05 μmol/L,瞬时转染miR-155 mimic,显著降低了ZF4细胞氟虫腈暴露的存活率.同时real-time PCR结果显示,其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低;而转染miR-155 inhibitor,抑制细胞内源性的miR-155则可显著增强ZF4细胞抵抗氟虫腈细胞毒性的能力,同时cyb561d2表达则显著增高.以上结果表明,miR-155参与氟虫腈毒理学效应,其表达量的高低可以影响氟虫腈作用下ZF4细胞的存活率,而其可能的途径之一是通过潜在靶基因cyb561d2的表达调控来实现. 因此,miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物,有望成为致癌环境化学物质对生物体作用机制研究的新途径.