一株产蛋白酶嗜碱菌株的分离、鉴定及酶学特性

【目的】筛选产蛋白酶嗜碱菌并对其进行鉴定和特性分析。【方法】利用碱性脱脂牛奶培养基分离纯化产蛋白酶嗜碱菌,通过形态特征、生理生化、16S rRNA基因序列分析以及DNA-DNA杂交实验确定菌株的分类地位,利用酪蛋白水解法分析所产蛋白酶的pH和温度作用范围、稳定性和耐氧化剂能力。【结果】从我国西藏盐碱湖样品中分离到一株产碱性蛋白酶的菌株ZL223,该菌株为革兰氏阳性菌,最适生长温度为37℃,最适生长pH9.0,16S rRNA基因序列分析显示,菌株ZL223与假强芽孢杆菌Bacillus pseudo firmus OF4亲缘关系最近,16S rRNA基因序列相似性为98.6%,DNA-DNA杂交结果显示与B.pseudofirmus OF4同源性为86%。菌株ZL223产生的蛋白酶作用的最适pH为12.0,最适温度为40℃。【结论】结合生理生化指标测定的结果,鉴定菌株为假强芽孢杆菌ZL223(B.pseudofirmus ZL223)。该菌株产生的碱性蛋白酶具有较高的pH适应性,值得进一步研究。     

用ISSR标记技术分析山药品种遗传多样性

利用ISSR标记技术对28个山药品种的遗传多样性进行分析。结果表明,从44条ISSR引物中可筛选出7条能够扩增出清晰、稳定条带的引物;这7条ISSR引物对28个山药品种扩增条带间存在较大差异,多态性条带比率为83.01%,Shannon多样性指数为0.3191;构建的分子树状图将28个山药品种划分为4组:第一组含有日本白、花山药和日本园3个品种;第二组为小叶山药;第三组为嵩野1号;其余23个品种归入第四组。而且主成分分析结果支持上述的聚类分析结果。这为利用ISSR标记技术鉴定山药品种,为有效地利用山药种质资源提供了依据。     

大叶秦艽的组织培养与植株再生

以秦艽的叶和下胚轴为外植体,成功地诱导出愈伤组织和再生植株.诱导愈伤组织最合适的培养基为附加2 m g·L- 1 2 ,4 - D和0 .5 mg·L- 1 6 - BA的MS培养基,诱导率可达到10 0 % .愈伤组织转移到附加2 mg·L- 12 ,4 - D和0 .5 mg·L- 1 KT和5 0 0 m g·L- 1 L H的MS培养基上进行继代培养,增殖后的愈伤组织转移到附加0 .1mg·L- 1 2 ,4 - D和0 .5 m g·L- 1 6 - BA的MS分化培养基上进行分化,其分化率可达到86 .6 7% ,将分化出的芽转接到不加激素的MS上,结果可生长出大量的分化苗.     

'早红'草莓高效遗传转化受体系统的建立

本文以草莓主栽品种'早红'组培苗离体叶片和叶柄为外植体,进行叶龄、暗培养、植物生长调节剂配比及抗生素敏感性研究,建立草莓高效遗传转化的受体系统.在含3.0 mg/L 6-BA与0.1 mg/L 2,4-D的MS培养基上,30 d叶龄的叶片再生频率高达98.31%,平均每叶片再生芽数5.09个,叶柄切段的再生频率为89.25%,平均每叶柄切段再生芽数4.92个,叶片的再生频率略高于叶柄;不定芽在含0.2 mg/L 6-BA与0.2 mg/L GA_3的MS继代培养基上培养成苗.将生长状态良好的不定芽转至含0.2 mg/L IBA的1/2 MS培养基上生根,生根率达100%,平均生根数量16.27条,平均根长1.85 cm.抗生素敏感性试验表明,草莓外植体适宜的卡那霉素选择压力为25 mg/L,头孢霉素的筛选浓度为300mg/L.本研究建立的再生体系可作为草莓遗传转化的受体系统.     

毛头鬼伞真菌具有抗烟草花叶病毒活性的y3基因的克隆及对烟草的转化

【目的】蛋白质Y3具有抗烟草花叶病毒(TMV)活性并由y3基因编码。本文的目的是从真菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中克隆y3基因全长并在植物体中展现其对TMV的抑制活性。【方法】我们利用试剂盒5′-Full RACE Core Set(TaKaRa)扩增了y3基因cDNA5′-端未知序列,通过RT-PCR获得了全长序列,并把该全长序列与CaMV 35 S启动子和NOS终止子一起插入多克隆位点(MCS)构建了植物表达载体pCAMBIA1301-y3,用于农杆菌介导的烟草转化。【结果】y3基因全长534碱基对,包含1个开放阅读框(ORF),编码一条含130个氨基酸残基的肽链(GenBank检索号:GQ859168;EMBL:FN546262)。其cDNA序列和由它推到的氨基酸序列均与已发表的y3基因部分片段有高度相似性(94%)。Northern杂交分析证实了y3基因在转基因烟草中得到表达。接种TMV的转基因植株表现出抗TMV的活性。【结论】我们克隆了y3基因全长并得到了转基因植株。在转基因植株中,由于y3基因的表达改善了植株的抗病毒活性。y3基因的克隆和表达无疑为该基因的进一步研究奠定了基础。     

草木樨状黄芪甲硫氨酸抗性系的原生质体培养及植株再生

建立了草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall．)甲硫氨酸抗性系原生质体再生植株的实验体系。以茎切段诱导的松软愈伤组织为材料,通过酶法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养持续分裂形成了愈伤组织,并高频率地分化出再生苗。比较了不同培养基、培养方法和培养密度对原生质体分裂和再生的影响。结果表明,原生质体以3×10⁵/mL的植板密度,采用琼脂糖岛法培养在附加1．0mg／L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0．5mg／L 6-苄氨基嘌呤(6BA)、500mg／L水解酪蛋白、3％蔗糖、0．3mol／L甘露醇的KM_8p培养基中,可获得最佳效果,其细胞分裂频率达38％左右。原生质体培养后仍然保持对甲硫氨酸的抗性,同时对乙硫氨酸表现交叉抗性。     

草木樨状黄芪抗甲硫氨酸变异系的离体筛选及鉴定

通过组织培养体系进行了草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall.)抗甲硫氨酸变异系的筛选。无菌苗幼茎切段诱导的愈伤组织经NaN_3诱变后,经过筛选获得了抗14mmol/L甲硫氨酸的变异细胞系,并分化出大量植株。再生植株已经在大田中开花结实。经分析表明:抗性细胞系脱离选择压6个月后,放在含15mmol/L甲硫氨酸的培养基上培养25天后,其相对增长率是对照的10.2倍。抗性系再生植株游离甲硫氨酸是对照的2.12倍,并且天冬族氨基酸都有明显增加。SDS-PAGE及过氧化物酶同工酶分析表明:在蛋白质及同工酶酶谱上抗性系再生植株均出现与对照不同的差异。     

沙打旺与苜蓿属间体细胞杂交

以豆科牧草沙打旺为一亲本,碘乙酰胺处理的紫花苜蓿发根农杆菌A_4菌株转化系为另一亲本,通过PEG-高pH,高钙法诱导原生质体融合。在不加外源激素的DPD 培养基上有效地筛选了杂种细胞。经培养首次得到沙打旺( )紫花苜蓿的属间体细胞杂种。尽管双亲原生质体均已丧失分化植株的能力,但杂种细胞系R_1仍得到苗的分化。杂种R_1细胞的染色体数检查、冠瘿碱检测、同工酶和RAPD 分析结果,都证实了其杂种特性。     

玉米Ubi-1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因-1启动子(Ubi-1)与大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因(gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自玉米未成熟胚盾片组织的I-型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织、细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达.UbiGUS在花粉、卵细胞和T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性.对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈11分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传.同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生.目前已得到第二代转基因种子.     

沙葱叶基愈伤组织原生质体再生体系的建立

沙葱是一种具有抗旱抗寒、抗病性和适应性强等生理特性的荒漠植物.为开发利用其固有的遗传资源,本研究利用细胞工程技术建立了沙葱(Allium mongolicum Regel)叶基愈伤组织原生质体的分离、培养和植株再生实验体系.研究结果表明,酶法分离原生质体的产率和分裂频率明显取决于用于制各原生质体的愈伤组织的状态.转代培养7～10d的松软愈伤组织可分离出大量有活性的.在附加2.0mg/L2,4-D、0.2mg/L激动素、500 mg/L水解乳蛋白、0.4 mol/L甘露醇和2%蔗糖的MS培养基中进行液体浅层培养,4～5 d后出现第一次原生质体分裂;7～10d出现第二次分裂.结果显示原生质体的分裂频率大约为5%;4周后,可见到小愈伤组织.当将原生质体分裂形成的愈伤组织转移到附加2.0mg/L6-苄氨基嘌呤(或激动素)和0.4mg/L萘乙酸(NAA)的MS固体培养基上,并在低光照条件下培养后,从愈伤组织上分化出了不定芽,进而发展成小植株,并移栽成活.本研究对沙葱抗逆遗传品质用于经济植物遗传改良的研究奠定了可行的实验基础.