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应用基于易错PCR随机突变的体外分子进化技术,来提高淀粉液化芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到3株热稳定性明显提高的突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分别比野生酶(18min)提高4min、13min和17min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min)、304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76mg/mL、6.19μmg/mL和6.84mg/mL,与野生型(6.29mg/mL)基本相同。序列分析表明,3个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R)、2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8%的替代氨基酸是精氨酸,也表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。 相似文献
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抗老化啤酒酵母研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
啤酒酵母是啤酒酿造的核心,对啤酒风味多样性及风味稳定性具有重要影响。风味稳定性是啤酒重要的质量指标之一,筛选或选育综合抗老化能力高的优良啤酒酵母菌株将成为有效解决该问题的途径之一。近年来,随着基因工程技术的发展及啤酒酵母基因组的不断阐明,人们对啤酒酵母菌种改良展开了大量的研究,以期解决啤酒酿造问题,改善啤酒质量。本文对采用传统方式及基因工程手段选育高产抗氧化物质或低产啤酒老化物质及老化前驱物的啤酒酵母的最新研究进展进行了综述。其中,对抗老化啤酒酵母的选育目标、评价方法及选育策略进行了讨论,并对抗老化啤酒酵母选育的研究热点及发展趋势进行了展望。 相似文献
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啤酒酵母的自溶会影响啤酒的风味和品质,对酵母自溶的调控是工业啤酒生产的迫切需求。前期在啤酒酵母自溶的研究中发现柠檬酸循环相关基因对酵母自溶有较大影响。为探究柠檬酸循环中异柠檬酸脱氢酶基因调控对自溶的影响,在典型拉格啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus H.)Pilsner中对IDP1和IDP2基因进行了破坏和过表达。结果发现IDP1基因的破坏能提高酵母的抗自溶能力,自溶96 h抗自溶指数为8.40,比原始菌提高了1.5倍。IDP1基因的破坏提高还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的供应,NADPH/NADP^(+)的比值为1.94,发酵结束时胞内ATP水平比原始菌提高1.8倍,活性氧(reactive oxygen species,ROS)相比原始菌减少10%。IDP2基因的缺失造成酵母快速自溶和NADPH供应的减少,自溶96 h抗自溶指数为4.03,NADPH/NADP^(+)的比值为0.89。发酵结束时胞内ATP水平相比原始菌减少8%,ROS是原始菌的1.3倍。本研究进一步阐释了柠檬酸循环相关基因对酵母自溶的调控机理,为选育自溶性能可控的优良酵母提供了理论基础。 相似文献
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线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程,对维持细胞内稳态具有重要作用。为探究线粒体自噬基因对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞抗氧化性能的影响,本研究分别构建了线粒体自噬相关基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失和过表达菌株,发现在过氧化氢(H2O2)胁迫6 h后,过表达ATG8、ATG11基因显著降低了细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,分别仅为初始状态的61.23%和46.35%,并显著提高了菌株线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)含量,有助于提高菌株的抗氧化性能。另一方面,基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失会导致线粒体损伤及细胞活力显著下降,同时造成胞内ROS失衡,H2O2胁迫6 h后,其胞内ROS含量显著升高至初始状态的174.27%、128.68%和200.92%。结果表明,ATG8、ATG11和ATG32可能是调控酵母抗氧化能力的潜在靶点。本研究为进一步研究通过调节线粒体自噬提高酵母抗氧化活性提供了新的线索。 相似文献
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