AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素E方法的建立

目的:利用AlphaLISA技术,建立新型均相检测方法,对金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)进行检测。方法:采用2种SEE抗体建立AlphaLISA检测方法,羊抗肠毒多克隆抗体同受体微球偶联,SEE小鼠单克隆抗体标记生物素,并同偶联了亲和素的供体微球连接,3种组分与待测抗原形成双抗体夹心结构,680nm的光激发供体微球产生能量,将周围反应体系中的氧分子转变为激发态,并将能量传递给受体微球,产生520~620nm的荧光,荧光信号与抗原浓度正相关。对该方法的反应体系进行优化,验证其重复性、敏感性和特异性,并采用该方法检测菌液上清和食品模拟样本。结果:所建立的AlphaLISA检测方法重复性较好,批间变异系数和批内变异系数皆小于10%;检测SEE的灵敏度可以达到100pg/mL,并与其他几种毒素均无交叉反应,具有较好的特异性。该方法也能够准确地对金黄色葡萄球菌菌液上清中的SEE进行检测,对食品模拟样本的检测也有较好的灵敏度。结论:建立了检测SEE的AlphaLISA方法。该方法均相免洗,操作便捷,用时短,灵敏度更高,可对菌液上清和不同食品模拟样本中的SEE进行检测。     

猪链球菌2型05Z33强毒株转录调控因子Rgg基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg的基因敲除突变体,观察其生物学性状,并在动物感染实验中比较敲除株与野生株的毒力差异,为进一步研究猪链球菌转录调控因子在致病中的作用提供实验基础。方法:分别以猪链球菌2型05ZYH33基因组和pSET1质粒为模板,扩增基因SSU05_1997两侧各约500 bp的片段为上下游同源臂,氯霉素(Cm)抗性基因为中间片段,采用重叠PCR方法连接3个片段;连接产物先克隆到T载体上,再经过酶切克隆到温度敏感自杀载体pSET4S上;将构建的基因敲除载体pSET4S-1997电转化入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度筛选出基因敲除突变体05Z33△rgg;对敲除株和野生株的生物学性状及小鼠和猪的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示基因SSU05_1997完全被Cm抗性基因所替代,基因敲除突变体构建成功;05ZYH33△rgg对小鼠和猪的致病性与野生株相比无明显差异。结论:转录调控因子Rgg可能和猪链球菌2型的毒力无关。     

Nano-SiO_2对子代雌性小鼠动情周期的影响

目的:探讨纳米二氧化硅(Nano-Si O2)对子代雌性小鼠动情周期的影响。方法:选择8周龄的ICR孕鼠6只,随机平均分为两组,一组在E5.5~E11.5时隔天注射纳米二氧化硅,另外一组注射PBS,每组取子代雌性小鼠各3只,待其自然生长到7周龄时,每日采用巴氏染色法检查其动情周期。结果:与注射PBS的子代雌性小鼠相比,注射Nano-Si O2的子代雌性小鼠的动情周期的总时间无明显差异(P0.05),动情前期的时间明显缩短,动情后期的时间明显延长(P0.05),动情期虽然缩短,但差异不显著(P0.05)。结论:孕期暴露于Nano-Si O2未导致子代雌性小鼠动情周期的紊乱,但对其生殖功能可能有一定的影响。     

猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg基因敲除突变体与野生株的基因表达差异分析

目的:为了解猪链球菌2型强毒株05Z33转录调控因子Rgg的调控作用,用基因芯片方法分析野生株与rgg基因敲除突变体之间的差异表达基因。方法:用猪链球菌2型全基因组序列点样制备芯片,将芯片运用于rgg敲除株与野生株的基因表达差异研究,采用定量real-time PCR(qRT-PCR)验证表达谱结果。结果:在突变体中共发现45个基因表达量变化在2倍以上,其中19个基因表达上调,26个基因表达下调。这些基因在细菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修复、基础代谢和ABC转运系统等方面起着重要作用。结论:转录调控因子Rgg是一个全局调控因子,但rgg敲除后并不影响猪链球菌的毒力。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌肠毒素C（SEC）,并对其活性进行检测。方法：以金黄色葡萄球菌基因组为模板扩增SEC基因,经测序正确后插入原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α后温度热诱导重组SEC表达;表达产物经阳离子柱纯化后,用ELISA鉴定其抗原性;通过观测表达产物对鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况,检测其超抗原活性。结果：构建了SEC-pBV220原核表达载体,在大肠杆菌中可快速、高效表达SEC蛋白,表达产物具有超抗原活性。结论：实现了SEC的原核表达。     

2型猪链球菌gene0969基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33毒力岛89K上的Ⅳ型分泌系统组分gene0969敲除突变体,初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增gene0969基因的上下游片段;以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm;采用重叠PCR方法搭建3个片段,并克隆到自杀载体pSET4s上,构建基因敲除载体,通过同源重组构建gene0969突变体,再用小鼠感染模型对突变株和野生株的毒力进行比较。结果:获得了gene0969基因敲除突变体,并发现其毒力与野生型相比有下降趋势。结论:2型猪链球菌假想毒力因子gene0969可能与毒力有关,其作用和机制值得进一步分析。     

金黄色葡萄球菌D型肠毒素抗血清制备和在肠毒素免疫检测上的应用

参考Robbins等文章,制定了制备抗-SED血清的免疫方案,抗原用量6.9mg/兔,注射8针,免疫时间共14周。用免疫双向琼脂扩散方法测定,抗-SED血清效价可达1:128,所制抗-SED血清与高纯度(98%)及低纯度(60%)的SED只产生一条沉淀线,并且融合,与SEA、SEB、SEC_1、SEC_2均没有交叉反应。以抗-SED抗体IgG制备的诊断血球检出灵敏度较高,约1ng/ml。对6种罐头食品人工污染毒素的模拟实验结果,检出灵敏度为1.56ng/ml,略低于含纯SED标本,食物成份对反向血凝检出没     

2型猪链球菌表面蛋白 Hp0272的原核表达及其结合人血清 IgA 的活性分析

目的：构建带GST标签的2型猪链球菌功能未知表面蛋白Hp0272的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,获得纯度较高的GST-Hp0272重组融合蛋白,鉴定其与人血清IgA（higA）的结合活性。方法：采用分子生物学方法构建pGEX-4T-1-0272重组表达载体,将其转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况;用GSTrap柱亲和纯化目的蛋白并经Western印迹验证,采用配体印迹和ELISA方法鉴定GST-Hp0272与hlgA的结合活性。结果：构建了GST融合蛋白原核表达质粒,并获得GST-Hp0272融合蛋白,鉴定到Hp0272特异性地与hisA结合,且结合区域位于Hp0272的N端（41-318an）。结论：获得了GST-Hp0272融合蛋白,并鉴定到其能特异性结合hlgA,为进一步了解Hp0272在猪链球菌致病过程中的作用提供了基础。     

2型猪链球菌Fbps基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:敲除2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33中的Fbps基因,研究该基因敲除对菌株生物活性及毒力的影响,为深入探讨猪链球菌致病机制提供实验基础。方法:从05ZYH33基因组中扩增Fbps基因上、下游同源臂,从pSET1质粒中扩增氯霉素抗性基因Cm,通过重叠PCR的方法将3个片段整合后连接到温敏自杀载体pSET4s上,电转入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失,最后经抗性筛选获得敲除株05ZYH33ΔFBPS,分析敲除株的生物学性状,以CD1小鼠作为体外感染模型对突变株和野生株进行毒力比较。结果:PCR分析和测序结果均显示Fbps基因敲除成功,动物实验结果显示Fbps基因敲除后05ZYH33的毒力有所下降。结论:与野生株相比,突变株对小鼠的毒力有所降低。     

副流感病毒IgM抗体AlphaLISA快速检测方法建立

副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)是较为常见且广泛的社区性获得性抗原,其感染率仅次于呼吸道合胞病毒.由于PIV感染的临床表现与其他呼吸道病毒感染无特异性差别,所以早期、快速、准确诊断尤为重要.本文建立PIV IgM抗体的AlphaLISA快速检测方法,PIV特异性抗原与待测样品中PIV IgM抗体结合使供体微珠和受体微珠相互接近时,激光激发级联反应,从而产生放大的信号.通过对PIV特异性抗原生物素标记量和稀释比例的摸索,确定最佳反应体系.该方法批内和批间变异系数均小于10％,与间接免疫荧光方法比对,总符合率高于95％,且不与其他7种常见呼吸道病原体的IgM抗体发生交叉反应.AlphaLISA方法操作简便,整个反应过程只需要25 min,可快速检测PIV的IgM抗体,为早期确诊PIV感染提供有效办法.