牛杀菌/通透性增加蛋白对脂多糖介导的炎性细胞因子表达的影响

杀菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)能结合并特异地中和来自革兰氏阴性菌外膜的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。为了研究牛源BPI蛋白及其N端结构域在LPS介导的免疫应答中的作用,本文将BPI全长1 449 bp编码区序列(BPI)和其N端714 bp的编码区序列(BPI714)分别导入m HEK293细胞,分析了稳定表达的BPI或BPI714对LPS介导的炎性细胞因子表达的影响。首先将构建的p LEX-BPI/p LEX-BPI714载体分别转染m HEK293细胞,获得稳定表达牛源BPI或BPI714的m HEK293细胞;然后用LPS刺激上述细胞,分别收集刺激前、刺激后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h的细胞,并同时收集未表达BPI或BPI714的m HEK293细胞在各时间点的样品作为对照;采用定量RT-PCR检测上述细胞中炎性细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB-1、NF-κB-2的相对表达水平,比较LPS刺激前后表达BPI/BPI714和对照细胞中上述基因转录水平的变化规律。研究表明,LPS刺激后,对照细胞中IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB-2表达水平在不同时间点均显著提高(P0.05),并呈现规律性变化;而稳定表达BPI/BPI714的细胞在同样刺激条件下,IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB-2基因的转录水平均未发生显著变化(P0.05)。根据我们的实验结果,在m HKE293细胞模型中BPI或BPI714均能显著降低LPS介导的炎性细胞因子表达,抑制LPS介导的免疫应答。这不仅为进一步研究BPI抑菌机制和利用其抑菌功能提供了可靠的实验依据,也为分析抗菌蛋白的抗菌效果提供了一种可靠的实验方法。     

Real-time PCR分析滴虫性阴道炎患者微生物组成的变化

目的探寻滴虫性阴道炎患者阴道微生物组成的特点,为临床诊治及减少疾病的复发提供参考依据。方法选取2016年5-6月复旦大学附属华东医院妇科门诊45岁以下确诊为滴虫性阴道炎的育龄期患者16例,以同期18例45岁以下育龄期健康女性为对照,采集患者和健康人上阴道壁1/3处的分泌物,进行常规临床分析和革兰染色,并以21种常见的阴道细菌的特异引物进行Real-time PCR检测,分析并比较这些细菌在滴虫性阴道炎患者和健康人阴道内的组成及变化。结果在18例健康人中,其中13例的阴道微生物组成以乳酸杆菌(Lactobacillus)为优势菌,3例的阴道微生物组成无明显优势菌群或者优势菌不为检测的21种常见阴道微生物,2例的阴道微生物组成以加德纳菌为优势菌;在16例滴虫性阴道炎患者中,只有2例患者的阴道微生物菌群以乳酸杆菌为优势菌,14例以厌氧菌如普雷沃属(Prevotella)、纤毛菌(Leptotrichia)和斯尼思菌(Sneathia)为优势菌。经Metastats进行组间差异分析,结果表明Lactobacillus crispatus、Leptotrichia amnionii、Eggerthella sp.和Peptostreptococcus sp.在两组之间差异有统计学意义(P≤0.05)。PCoA主成分析结果亦显示滴虫性阴道炎患者的阴道常见21种微生物组成与健康人有显著差别。结论滴虫性阴道炎患者阴道内微生物组成的多样性增加,普雷沃属、纤毛菌及斯尼思菌的明显增高可能滴虫性阴道炎的炎症发生有关,此结果对于临床治疗滴虫性阴道炎的及减少复发提供新的方向,具有一定的指导意义。     

基于沙漠化程度和NDVI指数的奈曼旗生态安全评价

从土地利用/覆被角度进行生态安全评价是土地资源可持续利用研究的核心和基础。在强调沙漠化过程影响的条件下,本文以乡镇为评价单元,以土地利用现状和对应的NDVI值为评价依据,将层次分析法(AHP)和综合评价指数法有机结合,对内蒙古奈曼旗地区的生态安全格局进行了综合评价。结果表明:从1985、1995和2005年3个分析年份的现状来看,奈曼旗的生态安全状况经历了极不安全-较安全-较安全、安全的临界状态的变化过程;安全区和较安全区域面积由零逐渐增加,到2005年二者区域面积之和占到了总面积的2/3之多;虽然局部地区如巴嘎波日和苏木出现恶化-好转-恶化的反弹趋势,但区域整体生态安全水平是好转的趋势。     

线粒体通透性转换孔在缺血预处理脑保护中的作用及机制

目的：线粒体通透性转换孔通透性改变是导致缺血再灌注损伤的原因,线粒体功能的致命性改变最终引起细胞凋亡,本研究旨在观察线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）在缺血再灌注及缺血预处理脑保护中的作用;方法：将体外培养8天的海马神经元细胞分为五组,正常对照组（A组）,缺血再灌注组（B组）,缺血预处理＋缺血再灌注组（C组）,苍术苷＋缺血再灌注组（D组）,缺血预处理＋苍术苷＋缺血再灌注组（E组）。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,罗丹明123染色流式细胞术检测线粒体膜电位,Western-blot检测Bcl-2,Bax的表达。结果：与A组比较,其余四组线粒体膜电位均降低,神经元凋亡率升高（P〈0．05）;与B组比较,c组线粒体膜电位升高,神经元凋亡率升高,Bcl-2表达上调,Bax表达下调（P〈0．05）;与c组比较,E组粒体膜电位降低,神经元凋亡率升高,Bcl．2表达下调,Bax表达上调（P〈0．05）。结论：我们在细胞及分子生物学水平对MPTP及缺血预处理的研究后发现,缺血预处理能有效减轻海马神经元缺血再灌注损伤,抑制缺血再灌注后神经细胞凋亡,其机制与抑制MPTP的开放有关。     

黄翅大白蚁后肠降解滤纸微生物群落的分析

黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi)具有高效降解木质纤维素的能力,其后肠内存在着丰富的共生微生物。采用活性电泳和变形梯度凝胶电泳的方法对黄翅大白蚁后肠降解滤纸微生物群落进行分析。活性电泳实验证实了此微生物群落纤维素酶的存在(内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶),变形梯度凝胶电泳实验鉴定出微生物组的群落结构,即7种细菌和3种真菌。本研究初步阐明了黄翅大白蚁后肠内与滤纸降解相关的微生物种类,为进一步了解黄翅大白蚁纤维素的降解机制以及生物质资源的高效利用提供了理论基础。     

传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

蚯蚓粪中乳酸菌的分离及其在大肠杆菌O157:H7中的抗菌活性

本研究利用SL培养基从蚯蚓粪中分离到54株具有产酸性能的菌株,并以E. coli O157:H7 (EDL933株)作为指示菌株,采用点种法检测分离菌株的抑菌活性.结果表明其中6个菌株对指示菌具有拮抗作用,通过形态特征,结合16S rDNA序列分析,初步鉴定该6个菌株分别为食物魏斯特菌(Listeria welshimeri)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和格氏乳球菌(Lactococcus garvieae).分离到的乳酸菌对E. coli O157:H7 (EDL933株)具有显著的抑制作用,发酵温度和初始pH值影响发酵液的抑菌作用,优化环境因子可以促进拮抗菌对E. coli O157:H7的抑制作用.本研究为进一步分离抗菌产物用于人畜共患病的预防和治疗提供了理论依据.     

圣草酚对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制

目的:探讨圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用MTT法筛选圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞损伤的有效保护浓度,进一步采用流式细胞术检测圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞的凋亡率的影响,并通过试剂盒检测圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞胆碱能系统受体活性的影响。结果:MTT结果显示2×10~(-3)μmol/L圣草酚可显著促进Aβ2_(25-35)诱导的PC12细胞增殖(P0.05)。流式细胞术结果显示2×10~(-3)μmol/L圣草酚和雌二醇均可以显著抑制Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡(P0.05),提高其乙酰胆碱及乙酰胆碱转移酶活性并且降低乙酰胆碱酯酶的活性(P0.05),且二者的作用相当,差异无统计学意义(P0.05)。结论:圣草酚可能通过提高Ach及ChAT的含量,降低AchE的含量,调节胆碱能系统相关酶的活性,发挥对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞的保护作用。     

一株培菌白蚁后肠木聚糖降解细菌的分离与鉴定

【目的】从培菌白蚁——黄翅大白蚁肠道微生物菌群中分离能降解木聚糖的细菌。【方法】以木聚糖为唯一碳源,利用刚果红染色,根据透明圈大小进行筛选。通过显微形态,革兰氏染色及16S r RNA基因序列分析进行菌株鉴定。二硝基水杨酸(DNS)法测定细菌生长过程中木聚糖酶酶活变化,比较酶活与菌株生长状况的关系。【结果】从黄翅大白蚁肠道中筛选到一株具有较高木聚糖降解活性的革兰氏阳性菌Mb1,16S r RNA基因序列分析表明为类芽孢杆菌属细菌,命名为Paenibacillus sp.Mb1。该菌培养72 h后菌体浓度达到最高,木聚糖酶酶活主要存在于培养液上清中,酶活在对数期增长快,在培养96 h时达到最高值,之后趋于稳定。【结论】从黄翅大白蚁肠道中分离出一株具有较高木聚糖酶活的类芽孢杆菌,可作为产细菌木聚糖酶的潜在优良菌株。     

重组CHO细胞C_(28)株S基因序列的测定及分析

目的测定重组CHO细胞C28株S基因序列,研究其遗传稳定性,并与已全基因序列测定的乙型肝炎病毒的S基因序列进行比较分析,预测和揭示现有疫苗株对当前疾病流行株的防病效果。方法从C28株中选取第22代、24代2、5代2、7代、28代2、9代3、0代、31代3、2代3、3代和34代细胞,根据GenBank中C基因型adr亚型乙型肝炎病毒的全基因序列设计引物。采用酚-氯仿法抽提CHO细胞基因组DNA,用PCR法扩增各代次细胞的S基因,回收700 bp左右的目的片段,克隆至pMD18-T载体上进行序列测定。利用生物学软件MEGA4.1和BioEdit进行S基因序列同源性分析,绘制系统进化树,分析与其他HBV病毒株S基因的同源性。应用实验动物测定C28株生产的重组乙型肝炎疫苗的效价。结果 C28株十一个代次之间S基因序列核苷酸和氨基酸同源性均为100%;C28株十一个代次S基因与其他病毒株S基因比较,与C基因型乙型肝炎病毒同源性最高,与其他基因型乙型肝炎病毒的核苷酸同源性达91.4%～95.1%,氨基酸同源性达84.5%～93.3%。免疫NIH小鼠结果显示5批重组乙型肝炎疫苗的效价均符合标准。结论 C28株S基因在传代及保存过程中具有较高的稳定性,对当前疾病流行株有较好的防病效果。