噬菌体Qβ病毒样颗粒的制备、纯化及鉴定

目的: 利用大肠杆菌原核表达系统制备噬菌体Qβ VLPs,验证其自组装能力,纯化后免疫动物以确定其免疫原性,同时制备兔多克隆抗体验证其在哺乳动物细胞中内化能力。方法: 合成pET-28-Qβ-CP质粒,利用大肠杆菌原核表达系统制备Qβ VLPs,通过蔗糖密度梯度离心纯化VLPs,将经凝胶层析柱Sephacryl S-400纯化的Qβ VLPs用透射电镜观察颗粒形态;纯化后的Qβ VLPs加入或不加入佐剂分别免疫新西兰兔,获得血清后用Protein G纯化得到兔多克隆抗体,通过Western blot确定制备的兔多克隆抗体特异性,并利用间接免疫荧光法对Qβ VLPs的细胞内化能力进行鉴定。结果: 制备并获得纯度较高的Qβ VLPs,通过透射电镜观察到大量直径约为28 nm的颗粒;Western blot结果表明制备的兔多克隆抗体能特异性识别Qβ VLPs,且在免疫实验中加入佐剂与不加入佐剂分别免疫动物,对抗体水平的影响不显著。间接免疫荧光法结果表明Qβ VLPs在哺乳动物细胞中具有内化能力。结论: 成功制备Qβ VLPs为后续研发以噬菌体Qβ VLPs为载体的相关疫苗奠定基础。     

Snai1 miRNA干扰质粒构建及胃癌细胞系稳定株筛选

目的:设计并构建针对Snai1的微小干扰核糖核酸(miRNA),最终鉴定出有效干扰质粒并筛选稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901。方法:设计并构建4对Snai1的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR microRNA及1对无效对照microRNA干扰质粒。将干扰质粒用罗氏BD转染试剂转染胃癌细胞株SGC-7901,通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光确定转染效率。分别用不同浓度l的杀稻瘟菌素作用于SGC-7901细胞,得到杀稻瘟菌素对SGC-7901细胞的筛选浓度。Westernblot检测4对干扰质粒、阴性对照质粒对snai1蛋白水平表达的影响。结果:测序表明,Snai1干扰序列及读码框完全正确,干扰质粒瞬时转染的SGC-7901细胞系在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光达85%以上。杀稻瘟菌素对于SGC-7901细胞的筛选浓度为5μg/ml。Westernblot结果显示,干扰序列Mi-1对Snai1有较强的干扰效果。结论:成功构建了Snai1干扰真核表达载体,同时筛选出有效干扰质粒及稳定转染株,为进一步研究Snai1在胃癌中的作用奠定了基础。     

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测副溶血性弧菌

利用DNA环介导恒温核酸扩增法（LAMP）针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计4条引物,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌.LAMP反应的过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果.实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60～65℃恒温条件下50min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰（HNB）,蓝色的阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为9.74pg/μL,PCR方法最低检出限为97.4pg/μL,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,且具有良好的特异性.LAMP方法用于快速检测副溶血性弧菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,所以LAMP方法检测副溶血性弧菌特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断.     

多彩红树林景观营造——彩叶乡土红树林植物海漆和南方碱蓬的调研与应用

基于现场调查,结合景观价值、生长习性、管理及病虫害、生态恢复价值等综合考量,建议应用海漆Excoecariaagallocha和南方碱蓬Suaedaaustralis形成生物多样性高、群落层次分明的显著彩色生态景观带,有效缓解红树林造林中“品种单一化”和“景观一致化”问题。真红树植物海漆在4-6月形成群落顶层的红叶景观,南方碱蓬可常年保持红色至深红色营造底层色块。这2种抗性强、易于管理的速生植物可应用至国内所有红树林自然分布区域。     

mCIM试验检测临床产碳青霉烯酶革兰阴性杆菌的应用价值

目的评估改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)在检测临床产碳青霉烯酶革兰阴性杆菌中的应用价值。方法采用mCIM、改良Hodge(MHT)及Carba NP试验分别检测106株碳青霉烯酶基因阳性的革兰阴性杆菌(36株肠杆菌科细菌、26株铜绿假单胞菌及44株鲍曼不动杆菌),并比较差异。同时,收集湘雅医院2016年1月-12月临床分离的非重复性耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌106株,同期随机选取100株分离的碳青霉烯类敏感菌株作为对照组,mCIM试验检测碳青霉烯酶,PCR检测碳青霉烯酶基因,分析其敏感性及特异性。结果 (1)106株碳青霉烯酶基因阳性菌株,mCIM试验:肠杆菌科细菌的敏感性、特异性为88.9%(32/36),铜绿假单胞菌均为阴性。MHT试验:肠杆菌科细菌的敏感性、特异性为77.8%(28/36),铜绿假单胞菌的敏感性、特异性为69.2%(18/26)。Carba NP试验:肠杆菌科细菌的敏感性、特异性为97.2%(35/36),铜绿假单胞菌的敏感性、特异性为57.7%(15/26)。鲍曼不动杆菌3种方法均为阴性。肠杆菌科细菌中,MHT与Carba NP试验差异有统计学意义(χ~2=6.222,P=0.028),MHT与mCIM试验差异无统计学意义(χ~2=1.600,P=0.343),Carba NP与mCIM试验差异无统计学意义(χ~2=1.934,P=0.357);铜绿假单胞菌中,MHT与Carba NP试验阳性,二者差异无统计学意义(χ~2=0.746,P=0.565)。(2)144株临床分离肺炎克雷伯菌(碳青霉烯类耐药及敏感菌株分别为44株、100株),采用美罗培南和亚胺培南分别做mCIM试验,其敏感性和特异性均为100%,且与PCR的结果一致。结论 mCIM试验在肠杆菌科细菌中敏感性高、特异性强,操作简单,结果易于判断,具有良好的临床应用价值。     

肺炎球菌1型荚膜多糖多克隆抗体制备与夹心ELISA法建立及其在多糖浓度测定中的应用

目的：利用肺炎球菌1型全菌体制备多克隆抗体,并且利用该抗体建立肺炎1型荚膜多糖夹心酶联免疫吸附分析法（ Enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA）,用于检测发酵和纯化过程中的多糖浓度。方法用灭活的1型肺炎链球菌免疫家兔6周,获得高滴度的抗多糖血清,经过亲和层析纯化,获得高纯度的兔抗肺炎1型多糖抗体IgG。以纯化IgG作为包被抗体,加入多糖样品,再以生物素化的抗体作为检测抗体,建立夹心ELISA法检测肺炎1型多糖浓度。确定标准曲线的最佳线性范围,并对该方法进行特异性、准确性和精密度验证。结果兔免疫血清经过双向免疫扩散检测抗体滴度可达1∶32;该方法的线性检测范围为1．56～50 ng/mL;最低检测限为3．13 ng/mL。在标准品中混入其他型别多糖或培养基,回收率分别为102％和108％;该方法批内精密度和批间精密度分别为6．08％和7．01％。结论建立的夹心ELISA方法,其特异性、准确性和精密度均良好,可以特异地检测肺炎球菌1型多糖浓度。     

外源Spd对盐碱胁迫下番茄幼苗氮代谢及主要矿质元素含量的影响

采用水培方法,研究了盐碱与Spd处理对两品种番茄（中杂9号和金棚朝冠）幼苗氮代谢及主要矿质元素含量的影响.结果表明： 盐碱胁迫下,番茄幼苗干生物量显著减少,植株生长受到抑制;叶片和根系硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）活性及硝态氮（NO₃^--N）、全N、全K、Ca²⁺、Mg²⁺含量显著降低,铵态氮（NH₄⁺-N）、Na⁺含量显著增加;两品种叶片及中杂9号根系谷氨酸脱氢酶（GDH）活性显著升高,金棚朝冠根系GDH活性变化不显著;叶片全P含量显著降低,根系全P含量显著升高（金棚朝冠）或无显著变化（中杂9号）.Spd处理通过增强NR、GS、GOGAT活性提高了植株对NH₄⁺的同化利用率,有效缓解了盐碱胁迫导致的氮代谢紊乱,进而促进不同器官对P、K、Ca、Mg、Na的吸收、释放或转运,在一定程度上维持了各元素之间的相对平衡,从而增强植株对逆境的适应能力.此外,盐碱对中杂9号的抑制作用及外源Spd对其氮代谢紊乱和营养失衡的缓解作用高于金棚朝冠.     

温度、pH及CO2对白藜芦醇与过氧亚硝基相互作用的影响

白藜芦醇(Resveratrol,Res)是植物在遇到紫外线照射、真菌感染等不利条件下自然产生的抗毒素,存在于多种植物中,具有明显的消炎、抗癌、抗血栓等作用。本文利用紫外-可见光谱法研究了Res与过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite anion,ONOO-)的相互作用,提出了反应机理。研究了温度、pH及CO2对Res与ONOO-反应的影响,结果表明低温、偏碱性pH有利于反应的进行;CO2存在时Res仍能与ONOO-反应,但反应机理与前面不同。     

PinX1的原核表达、纯化及其与hTERT的相互作用简

目的：原核表达人Pin2/TRF1结合蛋白X1（PinX1）,确定该蛋白与人端粒酶逆转录酶（hTERT）催化亚基的相互作用。方法：用PCR方法从乳腺文库中扩增PinX1基因的编码序列,克隆至pET-32a载体构建重组质粒pHis-PinX1,经双酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测His-PinX1的表达;用His磁珠纯化His-PinX1,在人肾胚细胞293T内检测His-PinX1与hTERT的相互作用。结果：扩增得到980bp的PinX1基因;Western印迹检测表明,相对分子质量约57x10。的His-PinX1获得表达,且纯化的His-PinX1与hTERT具有相互作用。结论：表达并纯化得到了与hTERT相互作用的His-PinX1,为深入研究PinX1的功能奠定了基础。     

酪蛋白激酶Iα与细胞信号通路

酪蛋白激酶Ⅰα(Casein kinase 1α,CK1α)广泛分布于各类真核生物中,是CK1家族的7个成员(CK1α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε)之一,序列结构高度保守。在哺乳动物中,CK1α参与多种细胞生理过程,包括膜转运,细胞周期,染色体分离,细胞凋亡和细胞分化等。此外,CK1α还参与Wnt/β-Cat,Hh及NF-κB等信号通路。将CK1α在各类信号通路的具体功能作一综述,为进一步研究其在信号通路中的地位提供参考。