生物大分子构象研究的一些新进展

生物学是研究生命现象的科学,是人类长时期以来对农林业、医药、畜牧以及发酵工业等生产实践的科学总结,而生物学的发展又反过来大大推动了工农业生产以及医药事业的发展。近年来,在物理学和化学的影响和渗透下,生物学的发展非常迅速,逐渐由观     

胍变性肌酸激酶复性复活过程中构象与活力的比较研究

本文讨论了经3M盐酸胍变性的兔肌肌酸激酶复性和复活的动力学过程,对二者进行了比较,以期从量的关系上研究酶的构象与催化活力之间的关系。从萤光和紫外差吸收光谱的变化看,复性过程基本上是变性过程的逆转。变性肌酸激酶复性遵循一级反应方程,以萤光强度变化为标志的速度常数k=2.2×10~(-3)秒~(-1)。酶复活过程却表明由两个一级反应所组成,其速度常数分别为k_1=0.97×10~(-3)秒~(-1),k_2=0.17×10~(-3)秒~(-1)。可见构象变化速度与复活过程中较快的反应速度相近。这说明在反映色氨酸及酪氨酸微环境的构象变化基本完成之后,活力恢复的过程还没有终结。可以认为兔肌肌酸激酶的构象与活力密切相关,酶的构象完整是催化活力的基础。     

硫硫键的分光光度法测定

本文主要介紹用分光光度計直接和間接測定硫硫鍵的二个方法。由Na_2SO_3和硫硫鍵反应而产生的巯基可以和对氯汞苯甲酸(PCMB)結合而引起紫外吸收增加。这是一个定量反应,从紫外吸收增加数值可以算出硫硫鍵的含量;为了避免其他紫外吸收物貭的干扰,也可以利用含有二苯硫代縮二氨基脲(双硫腙)的四氯化碳溶液抽提殘留的自由PCMB,从PCMB与双硫腙結合而引起有机相可見光(625mμ)吸收的減少而間接求得硫硫鍵的含量。Na_2SO_3能和PCMB可逆地生成具有紫外吸收特征的絡合物,在pH为9.6,温度为50度时,这一反应的平衡常数为6.7mM,但当Na_2SO_3浓度远較PCMB为过量时,这一反应并不影响用上述方法对硫硫鍵測定的准确性。也可以在反应完成后用加入較Na_2SO_3略为过量的H_2O_2消除这一絡合物对紫外光吸收的干扰。依靠紫外吸收的测定方法比較准确,測定誤差可在2%以內,而用双硫腙間接測定誤差約在5%左右。用上述二个方法对一些蛋白如胰島素、木瓜蛋白酶、核糖核酸酶、胰疑乳蛋白酶、胰蛋白酶、人血清白蛋白等蛋白貭的硫硫鍵及巯基进行測定的結果与文献上报告符合。此外,在改变測定条件时还清楚地观察到不同蛋白貭的硫硫鍵,甚至同一蛋白貭內不同硫硫鍵与Na_2SO_3反应的能力相差很远。例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的硫硫鍵較易反应,胰島素較难,而核糖核酸酶和木瓜蛋白酶分子中的某些硫硫鍵則要求更为強烈的反应条件。     

抑制剂影响生成两个酶中间物系统的动力学

我們用稳态的方法处理了抑制剂存在下,酶作用于一个底物,生成两个酶中間的系統,得到了該系統的动力学方程。根据微扰項消失的条件討論了用Lineweaver-Burk法作图时得到直綫关系的条件。当在不同的抑制剂浓度下,得到一組直綫交于第二象限或横軸时,則有K_1=K的关系。并且只有k_(+2)>>k_(+3)时,米氏常数才等于米氏絡合物的解离常数,亦即Botts和Morales的結論也能够在这个系統适用。此外对于在k_(+2)>k_(+3),和k_(+2)=k_(+3)的情况下,米氏常数与平衡常数之間的关系也进行了討論。应用本文推导的动力学方程,討論了胰凝乳蛋白酶,木瓜蛋白酶和半乳糖苷酶的动力学行为。鉴于一些轉換酶、裂解酶、(?)构酶、合成酶甚至于氧化还原酶也都包含两个酶中間物。本文的討論可能具有較为普遍的意义。     

从胰岛素A及B链重合成胰岛素 Ⅲ.活力恢复水平的进一步提高

本文进一步改进了从A及B鏈重合成胰島素时的某些条件,如避免使用脲、控制还原温度及时間、改进沉淀还原产物时的pH使还原型A及B鎚的回收更为完全,以及控制重氧化时的温度等,最后胰島素活力恢复水平可以达到原活力的50%左右。同时我們观察了拆开胰島素三个硫硫鍵时其生物活力丧失的过程,初步认为胰島素的必需硫硫鍵数是二个。     

蛋白质功能基团的改变与其生物活力的关系 Ⅲ.对硝基苯酰甲基溴对某些蛋白质活力的影响

对-硝基苯酰甲基溴(NPAB)在不太高的浓度之下对木瓜蛋白酶,核糖核酸酶,胰凝乳蛋白酶和胰島素等的生物活力有明显的抑制作用。当NPAB与胰島素或胰疑乳蛋白酶共同保温时,随着生物活力的下降也同时发生吸收光譜的变化。对于胰凝乳蛋白酶而言,355mμ光密度的增加与其活力的下降完全平行說明NPAB仅作用于一个必需基团,再从二氫肉桂酸对这一抑制作用的?た蠢?这一基团可能是酶活性中心的一部分。NPAB对胰島素及核糖核酸酶的作用受pH影响,說明这一反应受蛋白分手中解离基团的控制,并且从它的pK值看来,这一解离基团很可能是组氨酸的咪唑基。pH影响木瓜蛋白酶和胰疑乳蛋白酶与NPAB的作用較为复杂,可能有不只一种解离基团参与控制它們与NPAB的反应。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅳ.活性中心组氨酸残基的羧甲基化

(1)在过量半胱氨酸存在下微量溴代乙酸或碘代乙酸在pH5对木瓜蛋白酶有強烈的抑制作用,当抑制剂与酶的克分子比为0.5时,抑制即达完全。抑制前后木瓜蛋白酶巯基含量不变。溴代乙酸作用后所得到的羧甲基木瓜蛋白酶汞盐結晶,与木瓜蛋白酶汞盐結晶相同。(2)在6M尿素溶液中溴代乙酸与木瓜蛋白酶的作用速度显著降低,底物L-白氨酰胺及抑制剂对氯汞苯甲酸都具有保护作用。这些事实表明溴代乙酸的抑制与木瓜蛋白酶的催化活性有密切关系,其作用点很可能是活性中心所在。(3)以双相电泳层析进行氨基酸組成分析結果指出,溴代乙酸作用点很可能是組氨酸殘基。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅰ.对不同底物水解作用的比较

(一)氢离子浓度对木瓜蛋白酶水解不同合成底物的影响均属于非竞争性类型,即对不同底物的米氏常数皆与pH无关,pH仅影响最大反应速度。因此很可能木瓜蛋白酶的米氏常数即等于其与底物结合的解离常数。(二)甲醇对木瓜蛋白酶水解Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2有抑制作用,但对Cbz-白-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解却有显著的促进作用。(三)甘氨酸乙酯对Bz-精-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解亦有促进作用,但活力提高的程度各不相同。(四)根据以上结果对木瓜蛋白酶的作用机制作了简短的讨论。     

从胰岛素A及B链重合成胰岛素 Ⅳ.有关重合成的一些条件

利用二者溶解度的不同可以将无脲条件下拆开的胰岛素初分而得到较纯的S-磺酸型A及B链,再在中性pH用纤维素板电泳可以制得纯的S-磺酸型A链。将经过分离提纯的A及B链按不同比例重新混合还原重氧化结果表明活力恢复程度与A与B链的比例有关,A比B过量对活力恢复有利,A:B=1.5:1时活力恢复最高,可达天然胰岛素的50%左右。本文还对从S-磺酸型A及B链重合成胰岛素最有利的还原及重氧化条件进行了探讨,除其他条件外重氧化的最适pH为10.6。B链单独存在时其还原及重氧化速度均明显地较A链的相应速度为低,但二者共同存在时的还原及重氧化速度却与A链单独存在时相同,表明在溶液中自由A及B链间存在着对恢复活力有重要影响的相互作用,可能是通过次级链作用的相互作用。