细菌中钙信号的作用

摘要：越来越多的实验证明二价钙离子（Ca2+）在细菌中有重要调控作用。本文从Ca2+ 信号对细菌生理的影响、细胞内Ca2+ 浓度及测定方法、细菌中Ca2+ 的运输和Ca2+ 结合蛋白四个方面综述了目前细菌中钙信号的研究进展。     

多维蛋白鉴别技术分析天蓝色链霉菌膜内侧蛋白质组

链霉菌是一类具有重要工业价值和复杂调控机制的微生物,天蓝色链霉菌是这个属的模式菌。已报道天蓝色链霉菌的蛋白组学的研究多采用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱相结合的方法,但由于膜蛋白疏水性较强,天然丰度较低,此法得到的膜蛋白很少。用蛋白酶K保护/高pH蛋白酶K法制备链霉菌膜内侧蛋白组样品,并用多维蛋白鉴别技术进行分析,得到154个可能的膜内侧蛋白（包括膜内在蛋白和膜外周蛋白）,其中含跨膜区的膜内在蛋白44个,含3个以上跨膜区的膜内在蛋白有23个。此外,还鉴定了一批膜内侧蛋白的亲水性肽段及其在膜上的拓扑位置。该结果有助于对天蓝色链霉菌的膜蛋白进行拓扑学分类和功能研究。     

DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建

以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒.将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应,生成环化的DnaB-N蛋白.将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置,转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽(含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库.随机挑取20个克隆,测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列;挑取其中9个克隆进行表达.结果表明可产生大量的融合蛋白,90%的融合蛋白在16℃表达20 h后发生体内剪接.将在30℃表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化,通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量.     

CAR－bacillus菌亚单位核糖核酸RNA限制性内切酶图谱的研究

利用生物体中编码亚单位核糖核酸ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ,ＳＳＵｒＲＮＡ）的ＤＮＡ序列为引物,经ＰＣＲ法扩增到ＣＡＲ－ｂａｃｉｌｌｕｓ的大约１．５ｋｂ的ＳＳＵｒＲＮＡ序列,采用ＨｉｎｄⅡ、ＨｉｎｆⅠ、ＥｃｏＴ１４,ＨａｅⅢ和ｘｈｏⅠ等５种限制性内切酶进行酶切电泳分析,同时比较了来源于小鼠的ＣＢＭ株及来源于大鼠的ＣＢＲ株,未发现两者有差异。     

云南腾冲热泉土壤微生物基因组文库的构建与分析

采用冻融、蛋白酶K、SDS-高盐-加热处理法联合的方法,直接从云南腾冲地区的一个弱碱性高温热泉沉积样品中提取和分离环境混合基因组DNA,产量为每克样品1~2μg DNA,用Promega试剂盒纯化后进行PstⅠ部分酶切处理,电泳回收3~8kb的片段后,构建了pSK( )为载体的基因组文库,共获得25000个阳性克隆,平均插入片段长度为4.6kb。通过随机DNA序列测定和基因注释,发现外源插入片段含有未见报道的序列。     

四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定

将来源于水母的绿色荧光蛋白基因 (gfp)和来源于E .coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因 (tetR)共同构建到E .coli表达载体pET_30a +上 ,获得TetRC_端与GFPN_端融合蛋白。对经诱导表达并纯化后的融合蛋白 (TR∷GFP)进行荧光发射光谱分析表明 ,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性 ,即在 395nm激发下 ,可在 5 10nm附近有特征发射峰。在加入四环素后 ,融合蛋白在 395nm激发下 ,在400nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化 ,荧光强度普遍增加 ,且以 510nm处最大发射峰增幅最大 ,由原来 1132增至 2214 ,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大 ,结果表明该融合蛋白 ,能感受外界四环素 ,并产生一定的荧光变化。     

大肠杆菌-链霉菌高效接合载体的构建及其应用

以链霉菌质粒SCP2 的衍生质粒pHJL400为基础 ,构建了能够在大肠杆菌到链霉菌之间进行高效接合转移的质粒pGH112。pGH112含有在大肠杆菌和链霉菌中复制起始位点 ,以及分别在大肠杆菌和链霉菌中进行筛选的抗性标记。用pGH112转化EscherichiacoliET12567(pUZ8002 )后 ,与天蓝链霉菌 (StreptomycescoelicolorA3(2 ) )、除虫链霉菌 (Streptomycesavermitilis)、变铅青链霉菌 (StreptomyceslividansTK54 )、毒三素链霉菌 (StreptomycestoxytriciniNRRL15443)、委内瑞拉链霉菌 (Streptomyces.venezuelaeISP5230 )和红色糖多孢菌 (Saccharopolyporaerythraea)进行接合 ,发现本文构建的pGH112与pKC1139相比 ,接合转移效率较高 ,稳定性好 ,而且宿主范围较广。把组成型启动子ermE 与绿色荧光蛋白基因 (gfp)克隆到本文构建的pGH112 ,通过接合转移到链霉菌中 ,gfp获得表达,证明其可以用作基因接合转移的有效工具载体,这为研究链霉菌的基因功能创造了有利条件上。     

学生春季农业实习

组织上的问题正确地解决某些组织上的问题,对学生在集体农庄或国营农场顺利地进行农业实习,有着很大的意义. 组织学生的工作时间农业实习大纲所规定的春季各项作业,如果依照中学普通的作息时间,其中绝大多数是很难贯彻的.为此,必须重新组织学生的工作时间.     

用hu-RBC-SCID小鼠分离鉴定献血者巴贝斯样原虫

目的用人红细胞(RBC)替代SCID小鼠自身血循环红细胞而建立的人化小鼠模型,即hu-RBC-SCID模式小鼠,分离并鉴定献血者中隐性人巴贝斯虫病原的感染,确定输血患者的感染来源.方法去除NOD/shi-scid小鼠自身血循环红细胞,辅以肌肉注射兔抗小鼠血红蛋白生成素血清和大鼠抗小鼠RBC单克隆抗体,用人O型红细胞注入NOD/shi-scid小鼠血循环中,建成hu-RBC-SCID模式小鼠,接种献血者的RBC.结果接种献血者的RBC的hu-RBC-SCID模式小鼠的RBC中,出现巴贝斯原虫,并大量增殖,最高达到40%,经形态学、PCR等方法鉴定病原为 Babesia microti 样原虫,与患者的一致.结论 hu-RBC-SCID模式小鼠证实,患者确因输血感染;hu-RBC-SCID模式小鼠是人巴贝斯原虫研究理想的动物模型.     

多杀菌素生物合成基因簇启动子探测和转录时序

多杀菌素是对农业虫害防治及粮食仓储安全均具有重大意义的农用抗生素.为了深入揭示刺糖多孢菌合成多杀菌素的调控特点,首先通过建立基于报告基因的启动子探测技术,探测了多杀菌素生物合成基因簇的9个启动子活性.并进一步通过荧光定量PCR,分析了这9个基因和不在基因簇内的负责糖基前体供应和鼠李糖合成的4个基因的转录时序,结果表明多杀菌素生物合成基因簇内的9个基因在菌体生长进入稳定期时有较高的转录,这和发酵液中此时开始大量积累多杀菌素一致;同时还发现,簇外的4个与糖基供应相关的基因和基因簇内基因的转录时序不同,它们在菌体生长对数期有较高的转录活性,这暗示多杀菌素聚酮链的合成速率和参与后修饰的糖基底物供应的最优化匹配有可能是提高生物合成多杀菌素的前提和关键.