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91.
以蔗糖为底物利用重组大肠杆菌合成甘露醇 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】异型发酵乳酸菌可利用胞内产生的甘露醇脱氢酶将果糖高效转化为甘露醇,但果糖作为底物相对昂贵,不利于工业化生产。为了降低生产成本,必须选择廉价的底物。蔗糖相对便宜,并且大量存在于自然界中,能够被重组大肠杆菌利用产生甘露醇。蔗糖水解酶(Sucrose hydrolase)和甘露醇脱氢酶(Mannitol dehydrogenase)是发酵生产甘露醇中催化蔗糖转化成甘露醇的关键酶,构建蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶共表达菌株并进行相关研究是本文的主旨。【方法】利用PCR方法分别从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)基因组DNA中获得sac A和mdh基因,得到大小分别为1 502 bp和1 032 bp的目的基因,经序列分析后将其连接到表达载体p ET-28a(+)上,得到重组表达载体p ET28a-sac A-mdh。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况并测定其酶活。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为55.1 k D和37.8 k D,与预期分子量一致,实现sac A和mdh基因的表达。蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活分别为25.78 U/m L和14.56 U/m L。对重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-sac A-mdh进行发酵条件优化,甘露醇质量浓度达到45.19 g/L,总糖转化率为37.66%。【结论】与乳酸菌利用蔗糖发酵生产甘露醇相比,产量提高了6倍,且具有发酵周期短、稳定性高等优点,菌株的成功构建为甘露醇工业化生产奠定了基础。 相似文献
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阿维拉霉素产生菌SV微波诱变效应的研究发现:菌株SV对微波敏感(微波处理60s,SV菌株存活率低于10%),菌落形态变化大。微波诱变处理最佳作用方式为培养皿不加盖、快速冰上冷却,最佳处理时间为50s(其正突变率25.3%)。通过微波诱变处理、阿维拉霉素推理筛选,最终获得一株稳定性良好,阿维拉霉素产量达到21.5mg/L,较出发菌株提高119.4%的突变株SV-15。 相似文献
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启动子是控制基因转录的重要元件,也是合成生物学研究和细胞工厂设计的关键环节。糖酵解途径和三羧酸循环是糖类分解代谢的中心代谢,受到包括启动子强度在内的严格调控。为了筛选一系列能满足合成生物学研究和细胞工厂设计需要的不同强度的内源性组成型启动子,利用报告基因——红色荧光蛋白m Cherry和在线分析软件,系统研究了大肠杆菌糖酵解和三羧酸循环中27个启动子的强度和核心结构元件。结果表明:这些启动子的强度范围变化很大,最强启动子Pgap A的强度是最弱启动子Pacn A强度的43. 6倍;启动子的-10序列和-35序列与它们的一致序列也不完全相同,两者之间的距离为17±3bp;但是,启动子的强度和启动子的结构特征基本一致。应用最强启动子Pgap A在重组大肠杆菌DH5αΔpck中分别表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和丙酮酸激酶基因,它们的酶活性分别提高了0. 32和1. 57倍,柠檬酸产量也提高了124. 7%和75. 5%。这些不同强度的启动子为大肠杆菌的合成生物学研究和细胞工厂设计奠定了一定的基础。 相似文献
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谷氨酸棒杆菌是生产氨基酸、有机酸等的重要菌株,广泛应用于食品、医药领域。利用基因编辑技术对谷氨酸棒杆菌进行基因功能研究,在提高目的产物产量、发现新的基因功能等方面有重要意义。近年来,基因编辑技术发展日新月异,从基于同源重组的传统基因编辑技术到以人工核酸酶介导的基因编辑均在谷氨酸棒杆菌中得到合理应用。其中,CRISPR技术以其快速、简便、编辑效率高等优点成为现阶段研究者用于改造谷氨酸棒杆菌的主要技术,但是更为简单、高效的编辑手段依旧需要进一步研究开发,以获得优良菌株应用于工业生产中。 相似文献
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代谢工程大肠杆菌利用甘油高效合成L-乳酸 总被引:2,自引:0,他引:2
以甘油为碳源高效合成L-乳酸有助于推进油脂水解产业和生物可降解材料制造业的共同发展。为此,首先分别从凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans CICIM B1821和大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013中克隆了L-乳酸脱氢酶基因BcoaLDH和D-乳酸脱氢酶 (LdhA) 的启动子片段PldhA。将两条DNA片段连接组成了表达盒PldhA-BcoaLDH。然后将上述表达盒通过同源重组删除FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶编码基因lldD的同时克隆入ldhA基因缺失菌株E. coli CICIM B0013-080C (ack-pta pps pflB dld poxB adhE frdA ldhA)的染色体上,获得了L-乳酸高产菌株E. coli CICIM B0013-090B (B0013-080C,lldD::PldhA-BcoaLDH)。考察了菌株CICIM B0013-090B不同培养温度下代谢利用甘油和合成L-乳酸的特征后,建立并优化了一种新型L-乳酸变温发酵工艺。在7 L发酵罐上,发酵27 h,积累L-乳酸132.4 g/L,产酸强度4.90 g/(L·h),甘油到L-乳酸的得率为93.7%,L-乳酸的光学纯度达到99.95%。 相似文献
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利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。 相似文献
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旨在提高谷氨酸棒杆菌合成尸胺的能力,将CadB克隆至谷氨酸棒杆菌中,与LDC共表达,在谷氨酸棒杆菌合成尸胺的同时,帮助尸胺转运至细胞外,解除尸胺的反馈抑制作用。谷氨酸棒杆菌能够高产赖氨酸脱羧酶的底物L-赖氨酸,但不含ldc和cadB基因,因而不能够直接合成尸胺。从E.coliK12中克隆出赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因,与绿色荧光蛋白基因gfp融合构建成融合表达载体pXBG,并转化至谷氨酸棒杆菌进行诱导表达,结果表明表达的CadB蛋白可以正确的定位于谷氨酸棒杆菌的细胞膜上。将基因cadB连接到含有赖氨酸脱羧酶基因的pXMJ19-ldc上,构建成能够共表达赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白的重组质粒pXLB,并转化到谷氨酸棒杆菌中。 相似文献