利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产DHA的新型裂殖壶菌

以生产DHA的裂殖壶菌(Schizochxtrium)B4D1和黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.316为出发菌株,利用原生质体融合技术选育可以利用淀粉发酵生产DHA的新型裂殖壶菌。用裂解酶制得了两亲本的原生质体,通过研究两亲本培养时间、培养方法、酶解时间等条件对原生质体产量影响的基础上,以PEG介导进行了原生质体的融合,最终确定了原生质体融合最佳条件为40%的PEG6000,融合温度30℃,融合时间为10 min,在此条件下融合率可达1.9%。通过比较菌落外观、颜色、形态以及分离培养筛选获得了一株利用淀粉裂殖壶菌融合子。经过RAPD验证表明B4D1与CGMCC 3.316发生了重组,融合菌株表达了更多源于B4D1的遗传信息。     

以蔗糖为底物利用重组大肠杆菌合成甘露醇

【目的】异型发酵乳酸菌可利用胞内产生的甘露醇脱氢酶将果糖高效转化为甘露醇,但果糖作为底物相对昂贵,不利于工业化生产。为了降低生产成本,必须选择廉价的底物。蔗糖相对便宜,并且大量存在于自然界中,能够被重组大肠杆菌利用产生甘露醇。蔗糖水解酶(Sucrose hydrolase)和甘露醇脱氢酶(Mannitol dehydrogenase)是发酵生产甘露醇中催化蔗糖转化成甘露醇的关键酶,构建蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶共表达菌株并进行相关研究是本文的主旨。【方法】利用PCR方法分别从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)基因组DNA中获得sac A和mdh基因,得到大小分别为1 502 bp和1 032 bp的目的基因,经序列分析后将其连接到表达载体p ET-28a(+)上,得到重组表达载体p ET28a-sac A-mdh。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况并测定其酶活。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为55.1 k D和37.8 k D,与预期分子量一致,实现sac A和mdh基因的表达。蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活分别为25.78 U/m L和14.56 U/m L。对重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-sac A-mdh进行发酵条件优化,甘露醇质量浓度达到45.19 g/L,总糖转化率为37.66%。【结论】与乳酸菌利用蔗糖发酵生产甘露醇相比,产量提高了6倍,且具有发酵周期短、稳定性高等优点,菌株的成功构建为甘露醇工业化生产奠定了基础。     

响应面试验设计优化脱氢酶发酵培养基

目的:对简单节杆菌,TCCC11037发酵生产脱氢酶的培养基进行优化.方法:利用单因子试验筛选出最适碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏.采用Plackett-Burman(P-B)方法筛选出对产酶有重要影响的因素,并采用响应面试验设计(RSM)对重要因素进行优化.结果:葡萄糖、酵母膏、KH2PO4的浓度是影响脱氢酶产生的重要因素.优化后的培养基组成为(%):葡萄糖1.21,酵母膏0.65,KH2PO4 0.24,玉米浆0.8;培养基初始pH值7.0,接种量5%,通气条件为装液量100mL/500mL.结论:优化后脱氢酶活力达到24.57μmol/(g·min),得到了明显的提高.     

利用细胞质导人法选育嗜杀啤酒酵母

利用细胞质导入(Cytoduction)法中的核融合缺陷细胞融合技术,在对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D518菌株不做任何遗传标记,将嗜杀酵母5045菌株的嗜杀质粒转移到受体菌D518中,获得了具有两亲株优良性状的融合子KDl02菌株。对融合于分析表明：融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5045的嗜杀质粒,而且受体菌D518的核基因被原封不动地保留下来,为异质体细胞(Heteroplasmon)。将融合子KDl02菌株用于小型、中型及生产性酿酒试验。结果表明．具有与亲株D518同样的酿造特性。在发酵过程中．能抑制野生酵母污染,净化发酵体系。对于保证啤酒纯种酿造及提高成品酒的生物稳定性具有明显效果。     

诱导蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶条件的研究

用响应面法对蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）L-赖氨酸脱羧酶产酶诱导条件进行优化。首先通过单因素实验对产酶体系的pH、震荡培养时间、静置培养时间、诱导物添加量和Ⅷ添加量进行优化。在此基础上,用部分因子重复试验筛选出对酶活影响显著的3个因素（静置培养时间,诱导物添加量,VB6添加量）,再通过Box-behnken实验对这三个因素进行优化,得出最优值。最终得到产酶最佳诱导条件为：震荡培养阶段培养基pH6．5,静置培养阶段pH5．5;摇床震荡培养11h后静置培养7．5h,诱导物L一赖氨酸加入量为5．18dL,维生素B6加入量为1．38g／L时酶活最高,达到71．2U／mL,为优化前（1．74u／mL）的41．8倍,在单因素的基础上提高了19％。     

木质素过氧化物酶基因（LipH8）的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以黄孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)RNA为模板 ,克隆LipH8基因片段 ,研究LipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达。构建了甲醇酵母表达质粒pMETA_LipH8载体 ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiamethabolicaPMAD16 ,部分阳性克隆的PCR结果表明LipH8基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上 ,经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母工程菌株。胞外木质素过氧化物酶活力达 932U L。     

氮离子注入选育阿维拉霉素高产菌株的研究

以提高产绿链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)SV-1产阿维拉霉素(Avilamycin)产量为目的,采用低能氮离子注入技术,辅之以链霉素抗性筛选法进行诱变选育研究。结果表明,“马鞍”区域即注入剂量范围在3×10~(15)～5×10~(15)ions/cm~2诱变效果最佳,菌株的抗药性突变与产量突变密切相关,链霉素抗性筛选法具有可行性。在摇瓶条件下,最终获得稳定性良好,阿维拉霉素产量达到83．5mg/L,较出发菌株提高195%的突变株SVT-45。实验表明,离子注入技术是一种有潜力的微生物诱变育种新方法。     

甜蛋白Monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长 294bp的 monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体Pet_22b中,构建重组分泌型表达载体Petmo。经IPTG诱导Petmo所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8％。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。得到的甜蛋白热稳性及耐酸性均比天然产物有所提高。     

甘露醇磷酸化酶基因的敲除对D-甘露醇合成的影响

为了探究甘露醇分解利用途径对甘露醇合成的影响,在重组菌株R_1(K-12/pTrc99a-mdh)的基础上,通过CRISPR/Cas9敲除E.coli PTS系统中的cmtA、cmtB、mtlA基因,阻断了E. coli K-12中甘露醇的分解途径,获得了重组菌株R_3(K-12/?cmtA?cmtBmdh~+)和R_5(K-12/?cmtA?cmtB?mtlAmdh~+)。与出发菌株R_1相比,R_3的生长速率没有降低,而R_5的生长速率明显下降。并且R_5在以甘露醇为唯一碳源的培养基上已无法生长,说明cmtA、cmtB、mtlA三个基因全部敲除后,菌株已无法再利用甘露醇作为碳源进行生长。最后,构建的重组菌株R_5,测得MDH酶活力为258 U/mL,用高效液相色谱对胞外产物进行检测,可检测到少量的甘露醇,为进一步探究大肠杆菌合成甘露醇的调控机制奠定基础。     

葡萄穗霉中β-甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表达及酶学性质

【目的】以黑曲霉(Aspergillus niger)为宿主菌来表达葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)中的β-甘露聚糖酶(β-mannanase)基因。【方法】通过对葡萄穗霉全基因组进行比对分析,获得编码β-甘露聚糖酶基因s16942和s331的序列信息,通过设计引物,PCR扩增得到基因s16942和s331,连接到载体pGm上,并转化到黑曲霉中,获得的转化子经过amdS二筛平板复筛,测序验证,得到高效表达此基因的工程菌株G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331。【结果】SDS-PAGE检测结果显示,G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331表达的蛋白分子量大小分别约为48 kDa和60 kDa,且阴性对照中没有此条带。粗酶液的酶学性质表明,G1-p Gm-s16942表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为60°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达521 U/mL;G1-p Gm-s331表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达84 U/mL。【结论】本研究首次将葡萄穗霉的β-甘露聚糖酶基因转化到黑曲霉中并成功表达,并且具有较高的活性。