黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析

以黑曲霉(A.niger)TCCC41013的总RNA作为模板,通过RT-PCR扩增出含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因,将其插入pUCm-T载体上,经PCR和酶切鉴定后进行测序并分析.所克隆的PEP基因全长为1 581bp,编码526个氨基酸残基,成熟肽为504个氨基酸残基.与GeneBank中已报道的A.niger CBS513.88的PEP序列同源性最高,达到99.75%.脯氨酸蛋白内肽酶是一种新型的丝氨酸蛋白酶,黑曲霉PEP与已克隆的其他菌种的PEP同源性不高.     

细胞色素P450酶的结构、功能与应用研究进展

细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP)酶是广泛存在于微生物、动植物及人体中与膜结合的血红蛋白类酶,具有氧化、环氧化、羟化、去甲基化等多种生物催化活性。CYP酶在药物、类固醇、脂溶性维生素和许多其他类型化学物质的代谢中具有重要作用,其在异源物质的解毒、药物相互作用和内分泌功能等领域的研究是热点问题。本综述对CYP的结构、功能、临床应用与开发前景进行了概述,并对其最新的研究现状和发展前景进行探讨。     

枯草芽孢杆菌中一种新型双向启动子的功能鉴定

本研究旨在通过转录组分析预测的方法,由地衣芽孢杆菌中筛选获得一种新型双向启动子,鉴定其启动强度。以已知强组成型启动子pShuttle-09为对照,检测其对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达活性。成功构建了3种重组碱性蛋白酶表达载体及对应的工程菌株。在新型启动子pLA和其反向启动子pLB调控转录下,克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164 U/mL和111 U/mL。结果表明,pLA的启动强度明显高于pShuttle-09和pLB,pLA启动子与pLB启动子均可表达碱性蛋白酶。从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向,也为原核生物中共同表达两种基因提供了新的思路。     

黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达

将编码黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶(lip)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pMETA上,电转化Ade缺陷型甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)PMAD16,通过MD平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析和木质素过氧化物酶活力测定等方法鉴定,表明带自身信号肽的黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(lip)在甲醇毕赤酵母中得到表达。优化其发酵培养条件,以藜芦醇为底物进行酶活测定,其酶活可达932U/L。相应发酵指数为12.94U/h·L。比出发菌株提高了24.18%。     

促溶剂对雷斯青霉发酵液流变特性的影响

目的:促溶剂通常用于甾体生物催化过程以提高底物溶解度,但在发酵液中添加促溶剂对菌体形态及发酵液特性的影响还少有报道。方法:利用旋转流变仪和顺磁分析仪分别对发酵液的流变特性及体积氧传递系数KLa进行监测。结果:无论是否添加促溶剂,发酵液都表现出非牛顿流体力学特性,但添加3%1,2丙二醇后同一时期发酵液稠度系数减小大约17%,而流动指数平均增加8%。结论:添加促溶剂使得发酵液表观黏度减小,体积氧传递系数增大,从而有利于甾体化合物的生物转化。     

疏水性氨基酸的羟基化研究进展

羟基化氨基酸在生物技术和分子生物学中具有独特价值,具有抗真菌、抗菌、抗病毒和抗癌的特性。通过比较化学合成与生物催化合成羟基氨基酸的异同,选择具有高对映结构选择性的生物催化合成方法成为羟基氨基酸合成的首选。生物催化实现疏水性氨基酸的羟基化和羟化酶紧密相关,而羟化酶又是单核非血红素Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸依赖型双加氧酶(Fe/αKGDs)的一种,Fe/αKGDs存在共性催化机制。因此,疏水性氨基酸在被催化的过程中,会利用关键中间体高价铁-超氧复合体(Fe(Ⅳ)=O)引起多种氧化转化,从而完成羟基化过程。文中就疏水性氨基酸的羟基化合成及功能应用,尤其是(2S,3R,4S)-4-羟基-异亮氨酸(4-HIL)和羟脯氨酸,进行了详细的阐述,探讨了Fe/αKGDs的共性催化反应机制,并对羟基氨基酸在基础研究和工业中的应用进行了综述。     

三种益生菌混合培养及共生机理研究

确定酪酸菌、肠膜芽孢杆菌与粪肠球菌三种菌混合工艺.研究了三种菌混合培养的生长曲线,混合批式传49代、混合连续培养考察三种菌的共存稳定性.三种菌无细胞上清液彼此之间均有促进生长作用,混合培养液的菌数较单独培养增加,在稀释率0.042/h,填充床连续培养11d,三种菌可稳定共存,但批式传49代过程中,肠膜芽孢杆菌有消失现象,而酪酸菌、粪肠球菌均较传代前增加了100倍.平板打孔生长圈法、点种法实验分别表明酪酸菌、肠膜芽孢杆菌对粪肠球菌有显著的促进作用,连续培养较批式传代可更好的研究菌际关系.并得到简单易行的复方益生菌剂组方方法.     

重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究

利对重组枯草芽孢杆菌(pBES-pss)表达的磷脂酰丝氨酸合成酶进行分离纯化及酶学性质研究.pBES-pss发酵后的粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析,基本获得电泳纯的重组磷脂酰丝氨酸合成酶,比活力可达13.62 U/mg,分子量约为53 kD.酶学性质研究表明,该酶催化卵磷脂水解反应的最适pH8.0,最适温度为35℃.稳定性研究表明:该酶在pH 6.5～9.5 区间和低于45℃温度下稳定.表面活性剂及金属离子对该酶水解活性的影响结果表明,SDS、Tween20、Tween80对该酶有抑制作用,Triton X-100对该酶有增强作用;Mg2+、Zn2+、K+对该酶有抑制作用,Ca2+、Mn2+和EDTA对该酶有增强作用.     

解淀粉芽胞杆菌hemX基因缺失对血红素合成的影响

血红素是一种广泛存在于生物体中的卟啉类化合物,具有多种生理功能。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有易于培养、分泌表达能力较强等特点,是一种重要的工业菌株。为了筛选血红素合成的最优出发菌株,以不添加和添加5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)的方式,对实验室保藏菌株进行筛选,发现不添加ALA时,菌株BA、BAΔ6、BAΔ6ΔsigF的血红素产量无明显差别;然而添加ALA后,BAΔ6ΔsigF的血红素产量和比生产能力均为最高,分别达到200.77μmol/L和615.70μmol/(L·g DCW)。因此,以BAΔ6ΔsigF为出发菌株,敲除编码细胞色素组装蛋白HemX的hemX基因,探究其在血红素合成途径中的作用,发现敲除菌株发酵液明显变红,且生长未受到明显影响;摇瓶发酵12 h时ALA浓度最高,为82.13 mg/L,略高于对照的75.11 mg/L;不添加ALA时,血红素产量和比生产能力分别为对照的1.99倍和1.45倍;添加ALA后,血红素产量和比生产能力分别为对照的2.08倍和1.72倍;实时定量荧光PCR...     

黑曲霉催化雄甾-4-烯-3,17-二酮16β-羟基化

为进一步确定黑曲霉菌株TCCC41650的生物转化能力,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androstenedione)为底物,利用黑曲霉菌株TCCC41650进行催化,产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为16β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。转化条件为:培养液pH 6.0,乙醇添加量为2%,投料浓度为1‰时,72 h转化率为85.8%。目前甾体研究领域对于C16β-羟基化的微生物转化未见报道,研究结果为C16β-羟基甾体药物的研发奠定了基础。