解淀粉芽胞杆菌hemX基因缺失对血红素合成的影响

血红素是一种广泛存在于生物体中的卟啉类化合物,具有多种生理功能。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有易于培养、分泌表达能力较强等特点,是一种重要的工业菌株。为了筛选血红素合成的最优出发菌株,以不添加和添加5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)的方式,对实验室保藏菌株进行筛选,发现不添加ALA时,菌株BA、BAΔ6、BAΔ6ΔsigF的血红素产量无明显差别;然而添加ALA后,BAΔ6ΔsigF的血红素产量和比生产能力均为最高,分别达到200.77μmol/L和615.70μmol/(L·g DCW)。因此,以BAΔ6ΔsigF为出发菌株,敲除编码细胞色素组装蛋白HemX的hemX基因,探究其在血红素合成途径中的作用,发现敲除菌株发酵液明显变红,且生长未受到明显影响;摇瓶发酵12 h时ALA浓度最高,为82.13 mg/L,略高于对照的75.11 mg/L;不添加ALA时,血红素产量和比生产能力分别为对照的1.99倍和1.45倍;添加ALA后,血红素产量和比生产能力分别为对照的2.08倍和1.72倍;实时定量荧光PCR...     

两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响

背景:碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种具有广泛用途的工业酶制剂,其发酵活力目前仍不能满足工业生产需要。目的:旨在通过优化启动子及其组合来提高Bacillus subtilis WB600中碱性蛋白酶AprE的产量。方法:以Bacillus subtilis WB600为出发菌株,成功构建了含有4种不同类型启动子(P1、P2、P-1-2、P-2-1)的碱性蛋白酶AprE表达菌株。结果:含不同启动子的4株重组菌均可成功表达碱性蛋白酶,发酵48h,含单一启动子P2的重组菌株表达碱性蛋白酶的活力为4 041U/ml,是P1的1. 23倍。双启动子重组菌B. subtilis WB600/P-2-1-aprE表达的酶活性最高,是双启动子P-1-2的1. 35倍,达到了6 125U/ml。结论:为工业化高产碱性蛋白酶提供了一种有效策略。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

赭曲霉的高密度培养对坎利酮转化的影响

目的:研究赭曲霉高密度培养的发酵培养基及条件,实现坎利酮的高转化.方法:选取廉价易得的培养基成分并进行优化,同时对发酵条件进行优化,得到了最优发酵培养基配方及培养条件.结果:发酵培养基最优配方为:葡萄糖20g/L,玉米浆20g/L,酵母膏20g/L,K2HPO4 2.5g/L.种子液最佳培养时间为24h,发酵培养基初始pH 5.8,接种量为8%,装液量200mL/1000mL,摇床转速为180 r/min,28℃,底物投料时间24h,发酵结束时间72 h.结论:将该工艺在7L发酵罐中放大,菌体密度达到25.36g/L,11α羟基坎利酮的转化率为86.1%.     

重组枯草芽抱杆菌的构建及对街体的Cl , 2 位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。     

嗜碱芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶基因启动子的克隆及应用

摘要: 利用TAIL-PCR方法从嗜碱芽孢杆菌PB92基因组中扩增出碱性蛋白酶基因上游启动子活性片段, 测序分析后登录GenBank(EU130686)。此序列具有多个启动子特征区域, 且在－538~－370 bp和－275~－128 bp两个区域存在反向读码框。对启动子片段进行功能缺失的分析结果表明, TSS上游105 bp片段具有明显启动子活性, 但以长为414 bp~619 bp时活性更为显著。此外, 对PB92碱性蛋白酶的信号肽分析结果表明, 此信号肽具有典型分泌型(Sec-type)信号肽结构。将PB92碱性蛋白酶基因启动子和信号肽序列克隆入pBE2, 构建成表达载体pBEAC, 并以其为载体实现了植物甜蛋白monellin基因在枯草芽孢杆菌1A751中的高效表达。     

眠安胶囊原料药的提取工艺研究

目的:研究眠安胶囊的有效部位及黄芩和琥珀等药材的提取条件.方法:采用正交试验设计,以黄芩苷含量和提取物收率为指标,筛选出了黄芩提取的最佳条件为黄芩粉碎为最粗粉,用10倍水煎煮1.5h后再用8倍量水煎煮0.5h,减压浓缩(60 ℃～70 ℃)煎液至体积为投料量的5倍,于70 ℃加稀盐酸调pH值为1～2,保温30min后静置8h;以药效学为指标,确定了琥珀等药材渗漉提取用乙醇的浓度为70%,同时以药效学和干浸膏得率为指标,通过单因素试验确定了琥珀等药材提取的最优条件为10倍量70%乙醇浸渍24h,调渗漉速度为3 ml·min-1·kg-1进行渗漉提取.结果:眠安胶囊的有效部位为黄芩用水煎煮、琥珀等用乙醇渗漉提取的部位.结论:该工艺稳定,重复性好,适合于眠安胶囊原料药的提取.     

胡芦巴水溶性甾体皂苷的提取分离工艺研究

以薯蓣皂苷元的提取率为指标,应用L9(3^4)正交试验设计优化了从脱多糖、脱脂胡芦巴豆粉中提取甾体皂苷的工艺条件,并且筛选了ZTC澄清剂对胡芦巴甾体皂苷水提取液的澄清条件。实验结果表明,影响水提取的主次因素为：提取次数＞提取温度＞固液比＞提取时间;最佳水提取条件为：固液比为1：10,在70℃下提取3次,每次120min得出胡芦巴种子水提取液的澄清条件如下：ZTCl 1澄清剂的加入次序是先加B组分再加入A组分;澄清剂B和A的最佳用量分别为1．0g/L和O．5g／L;加入组分A或B后在80℃下作用30min即可达到澄清目的。     

黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达

将编码黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶(lip)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pMETA上,电转化Ade缺陷型甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)PMAD16,通过MD平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析和木质素过氧化物酶活力测定等方法鉴定,表明带自身信号肽的黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(lip)在甲醇毕赤酵母中得到表达。优化其发酵培养条件,以藜芦醇为底物进行酶活测定,其酶活可达932U/L。相应发酵指数为12.94U/h·L。比出发菌株提高了24.18%。     

里氏木霉306生物合成t-PA的代谢调节机制的研究

对基因工程菌株里氏木霉 (Trichodermareesei) 30 6生物合成组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)的代谢调节机制进行了研究。在基础发酵条件下 ,L 山梨糖、D 果糖、可溶性纤维素、CMC、麦芽糖、乳糖和棉子糖等单糖及多糖对t PA生物合成都有诱导作用 ,其中L 山梨糖的诱导效果最好 ,加量以 1 .0 %为宜。葡萄糖及其中间代谢产物对t PA的生物合成产生分解代谢物阻遏作用。纤维二糖在低浓度时可以促进t PA的生物合成而在高浓度时对t PA生物合成起反馈阻遏作用