藻蓝蛋白裂合酶CpeS半胱氨酸的定点突变及功能研究

藻蓝蛋白β亚基(简称β-CPC)中有2个色素结合位点(Cys-84和Cys-155)分别以硫醚键与藻蓝胆素(PCB)连接[1,2].     

蓝细菌6803中糖基转移酶Sll1466对胁迫响应及其对糖基化、磷酸化反应的调控作用

糖基转移酶存在于原核和真核生物中,参与低聚糖和多糖的生物合成,在生物转化过程中起着重要的作用．本研究中我们去除了Synechocystis PCC 6803中的糖基转移酶基因sll1466．在不同培养基的光合自养条件下,Sll1466缺失突变体较野生型的细胞内部结构变化明显(超薄电镜观察),突变体在缺碳培养基条件下羧酶体含量比野生型高,并且在0.5 mol/L NaCl条件下的肝醣含量也明显高于野生型．突变体在不同光密度生长条件下的吸收光谱与野生型差异明显．分子水平上,突变体较野生型显现出如下3个方面的差异：a．2个碳水化合物选择性OprB孔蛋白在类囊体膜上发生糖基化;b．核杆连接蛋白CpcG1(Slr2051)在类囊体膜的上清中发生磷酸化;c．与上述表型差异相关的基因的转录水平亦呈现相同的变化趋势．这些结果预示着Sll1466在调控蓝细菌6803生理、代谢及能量转化等方面有着重要作用．     

UV-C光催化纳米TiO2对蓝藻生长影响的研究

研究了UV-C光催化纳米TiO2对蓝藻生长的影响。从生理上分析了UV-C光催化纳米TiO2具有促进蓝藻中鱼腥藻7120体内活泼态氧化物O2,.OH和H2O2的产生,抑制藻体中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧歧化酶(SOD)在内的抗氧化酶活性,降低可溶性蛋白(Soluble Pr)、藻蓝蛋白(C-PC)、叶绿素a(C-Chl a)和类胡萝卜素(C-Carotenoids)含量,最终表现为藻细胞生长代谢中光合速率和呼吸速率迅速降低,细胞增殖中遗传物质核酸含量下降,并出现几乎达到100%的细胞致死率;同时,通过显微镜观察发现,受试蓝藻细胞形态结构发生了明显变化。可以看出,UV-C光催化纳米TiO2能够有效抑制蓝藻生长。     

藻蓝蛋白裂合酶CpeS色氨酸定点诱变及体内重组功能研究

为了研究藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS结构与功能的关系以及色氨酸残基对于该酶功能的影响,构建了藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS的两个色氨酸突变体,分别为CpeS（W14I）和CpeS（W75S）。通过体内重组检测酶活性的变化,研究色氨酸残基的突变对裂合酶催化活性的影响。重组结果显示：突变体CpeS（W14I）的催化活性几乎完全丧失,为野生型的8％;突变体CpeS（W75S）的催化活性为野生型的76％。由此推测,第14位色氨酸可能是CpeS酶活性的必需氨基酸,其所处的位置可能是裂合酶CpeS的活性位点。     

层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因的克隆及序列分析

克隆并测定了层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因全序列,通过将其氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行比较,表明层理鞭枝藻中cpcE,cpcF所编码的蛋白质是层理鞭枝藻中α-CPC生命合成的连接酶。     

层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基的分离纯化和结晶

藻红蓝蛋白α－亚基具有儿可逆光致变色性质。采用ＤＥＡＥ－纤维素柱层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝胶过滤、ＦＰＬＣ－Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０柱层析等纯化方法,得到了电泳纯的藻红蓝蛋白α－亚基,光化学活性达９３％。在室温、避光条件下,采用悬滴汽相扩散法,得到了两种外形不同的藻红蓝蛋白α－亚基晶体,进一步证实了上述纯化方法的可靠性。     

藻红蓝蛋白β亚基体内重组及其色谱分析

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白,其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接.大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多.藻红蓝蛋白由两个亚基组成,β亚基(简称β-PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB),分别在Cys-84和Cys-155位以硫醚键共价相连.通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为藻红蓝蛋白β亚基(β-PEC)中的Cys-84与PCB的连接的催化酶.为了研究层理鞭枝藻藻红蓝蛋白(PEC)β亚基(β-PEC)中藻蓝胆素(PCB)与脱辅基蛋白的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-PecB(C155I),分析表明该色素蛋白与β-PEC的吸收光谱和荧光光谱一致.酸性尿素变性实验证明得到的色素蛋白中的藻蓝胆素PCB没有被破坏.使用胃蛋白酶对天然藻红蓝色素蛋白和重组藻红蓝色素蛋白进行相同条件的水解并得到各自的色素肽,高效液相色谱分析表明这两种色素肽相同,由此证明了编号为alr0617基因编码的蛋白质能催化PCB与PecB(C155I)正确共价偶联.     

藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组

利用在大肠杆菌中表达的藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素PCB重组,吸收光谱、荧光光谱和高效可逆光化学性质分析表明,藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素直接重组,生成的胆素蛋白中辅基色素仍为藻蓝胆素;而藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素在藻红蓝蛋白α－亚基重组酶（pecE和pecF基因的表达产物）催化下重组,生成的胆素蛋白中辅基色素转变为藻紫胆素,并具有高效可逆光化学特性。