小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

Δ8途径是合成多不饱和脂肪酸的替代途径,Δ8-脂肪酸脱氢酶是该途径的关键酶之一。根据已报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从小眼虫藻基因组DNA和cDNA中扩增得到该基因片段,序列分析表明：结构基因长1 266 bp,编码421个氨基酸;该基因没有内含子,比已经报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因长6 bp,并且N末端序列也有所不同。利用酿酒酵母的载体pYES2.0构建Δ8-脂肪酸脱氢酶表达载体pYEFD,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在选择培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YD8。YD8在合适的培养条件下,添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并诱导基因表达。脂肪酸甲酯气相色谱分析表明小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效表达,将二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分别转化成二高-γ-亚麻酸和二十碳四烯酸,其底物转化率分别达到了31.2％和46.3％。     

提高大肠杆菌通过MVA途径合成异戊二烯

异戊二烯是橡胶合成的重要前体物质。为了提高菌株的异戊二烯产量,本实验室在研究中构建了一株异戊二烯产气的菌株BW-01,基于蛋白质预算理论的指导,理性设计通过改变质粒拷贝数、增加稀有密码子等合成生物学手段调控关键限速酶编码基因表达,从而提高大肠杆菌外源MVA代谢途径的异戊二烯产量。摇瓶发酵实验中我们构建的新产气菌株BW-07比原有的产气菌株BW-01的产量提高了73%,达到了761.1 mg/L。为后续菌株改造及进行发酵罐实验奠定了基础。     

β-烟酰胺单核苷酸的生理活性与合成研究进展

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)作为辅酶Ⅰ(即NAD+)的关键前体之一,广泛存在于多种生物中,β异构体为其活性形式。研究表明β-NMN在多种生理代谢过程中起关键作用,作为抗衰老、改善退行性疾病和代谢性疾病的潜在活性物质,β-NMN的应用价值被深度发掘,实现规模化生产迫在眉睫。生物合成法因其具有高立体结构选择性、反应条件温和、副产物少等优点,成为合成β-NMN的首选方法。本文综述了β-NMN的生理活性、化学合成法和生物合成法,其中重点介绍生物合成法中涉及到的代谢途径,旨在探索利用合成生物学优化β-NMN生产策略的潜力,为β-NMN的代谢途径研究与高效生产提供理论基础。     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白Al的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载胎蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JMl09宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。     

自制载体冷冻小鼠原核期胚胎效果分析

目的探讨自制冷冻载体冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎的可行性。方法首先,比较了两种流行的商业化载体:开放式拉长麦管(open pulled straw,OPS)和冷冻帽(cryotop)开展小鼠原核胚玻璃化冷冻保存效果。其次,以cryotop为对照,利用自制简易载体(cryotip)开展小鼠原核期胚胎的玻璃化冷冻保存。之后,利用ANOVA对各组胚胎在复苏后的体外培养卵裂率、囊胚率进行统计分析。结果 OPS和cryotop两组之间,胚胎在玻璃化冷冻/复苏后发育的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率差异均无显著性(P0.05),但cryotop冷冻效果更接近对照组;cryotip玻璃化冷冻载体与cryotop相比,胚胎复苏后各组差异均无显著性(P0.05),数值上除了2-细胞发育率外,cryotip其他几项结果都稍微高于cryotop组。结论 OPS,cryotop,cryotip冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎均是可行的;cryotop在冷冻效果上要优于OPS,笔者自制的cryotip因其成本低,制作简单,操作安全可靠,在实验中替代昂贵的商业化载体OPS和cryotop是可行的。     

三峡库区消涨带特有植物疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)的自然分布及迁地保护研究

疏花水柏枝为三峡库区消涨带特有植物,三峡工程的兴建将导致其野生居群全部灭绝。作者对该植物的地理分布、自然生境和群落结构进行了系统调查,发现疏花水柏枝分布于三峡库区重庆市巴南区至湖北省宜昌县间12个县级单位的长江干流消涨带,共31个居群9万余株,比原已知的分布区增加了7个县级区域18个居群8万余株。调查中发现该物种具有喜温湿、耐水淹和生长反季的生长习性,具有种子多、易扦插的繁殖优势和自然居群中物种少、水淹前后物种组成有差异的群落结构特点。同时,较系统地回顾了目前关于疏花水柏枝迁地保护的研究进展,探讨了其特殊的生态适应策略、起源进化和传播的可能途径以及濒危机制,并对下一步的保育研究提出了建议。     

不同信号肽对毕赤酵母表达漆酶的影响

【目的】从毕赤酵母X-33的内源分泌蛋白中寻找高分泌能力的信号肽,以提高漆酶POXA1c的表达水平。【方法】通过二维电泳的数据分析,以及毕赤酵母的基因组测序结果筛选出7种毕赤酵母中高分泌水平的蛋白,利用其引导漆酶的分泌,通过测定漆酶的活力,来确定信号肽的分泌能力。【结果】七种信号肽都能引导漆酶的分泌,其中PHO5和FLO10信号肽,其引导下漆酶POXA1c的活力分别是自身信号肽引导下的2.5倍和2倍。组合信号肽FLO10-αpro和PHO5-αpro引导下漆酶的活力分别为自身信号肽引导下的3倍和3.5倍,分别比在α-MF引导下提高了20%和40%。【结论】毕赤酵母内源分泌蛋白的信号肽可以有效的引导外源蛋白的分泌,漆酶POXA1c在PHO5-αpro信号肽引导下,通过高密度发酵培养后,其漆酶活力达到57.98 U/m L。     

红穗苔草对天鹅洲湿地淹水时间变化的形态学响应

以天鹅洲湿地的优势种红穗苔草（Carex argyi）作为研究对象,以淹水持续时间作为水位变化的衡量指标,选取3个淹水持续时间不同的位点,研究了淹水时间长短对红穗苔草形态指标的影响。通过野外原位观测试验发现,红穗苔草的株高及叶片的长、宽对淹水时间的长短反应敏感,而单个分株上的绿叶数对淹水时间的长短不敏感。适度的淹水可以显著增加叶片的长度和株高,长期淹水和相对干旱的环境不利于叶片的伸长和株高的增加。短时间淹水处理株高一直维持较高的水平,并保持相对的稳定。淹水会显著增加叶片的宽度,长时间淹水的处理效果更明显,且维持时间较长。长期淹水会提高红穗苔草地上部生物量的分配比例。尽管不同水位点土壤氮含量有显著差异,但是氮对红穗苔草形态指标并无显著的影响。以上实验结果表明,红穗苔草可以通过调节其叶片的形态及地下和地上部分生物量的分配比例来适应淹水胁迫的不利环境,有利于其在水位波动条件下种群的稳定和维持。     

用PCR-LiPA技术研究HLA-DR4基因与类风湿性关节炎的相关性

研究了HLA－DR4基因及亚型与湖南地区类风湿性关节炎的相关性。实验应用第12届国际HLA协作科研（12thIHWC）提供的生物素化的PCR引物,特异性地扩增HLA－DR4基因的第2外显子。扩增产物变性后,与已固定在膜上的一套序列特异性富核着酸（SXi）探针作线性杂交,再利用碱性磷酸酶标记的链酶亲和素与生物素结合,加入底物澳氯丐队磷酸／四晔氮蓝（BCIP／NET）,使杂交带显色,由反应格局判定IllH一DR亚型,即PCR－LCh技术。使用此技术可检测DRBI．04组特异性22个等位基因（DRBI．0401～0422）。研究表明所调查的湖南地区正常…     

载脂蛋白A-Ⅰ抗动脉粥样硬化的研究进展

载脂蛋白A-是HDL最主要的结构成分,是卵磷脂胆固醇酰基转移酶的主要激活剂。它决定了HDL的代谢和在血浆中的浓度。实验已经证明,载脂蛋白A-Ⅰ具有抗动脉粥样硬化症的功能。在这里阐述了载脂蛋白A-Ⅰ的结构和制备;载脂蛋白A-Ⅰ和HDL的关系以及它在抗动脉粥样硬化方面的作用和可能的机理：胆固醇的逆向转运、抗氧化作用和调节炎症反应。