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21.
【背景】通过CRISPR结合λ-Red同源重组技术进行染色体编辑是大肠杆菌遗传改造的重要手段。虽然目前已经有多个以CRISPR为基础的大肠杆菌基因组编辑策略,但这些方法往往涉及单独质粒消除、多片段组装等过程,存在效率低、操作繁琐、耗时长等问题。【目的】建立一种基于不同温度敏感程度的多种质粒协同使用的大肠杆菌快速、连续、高效的CRISPR基因组编辑方法,提高CRISPR在大肠杆菌基因编辑过程中的效率。【方法】将传统CRISPR方法中使用的pTarget质粒改造为RK2ts型温敏型质粒,并采用pTW-A/S两种抗性标记质粒交替使用的方法消除假阳性,实现质粒消除与下一步基因组编辑同步进行。【结果】在相同温度下RK2ts型质粒先于pSC101ts型质粒发生丢失,从而能够选择性缺失RK2ts型质粒pTW-A/S。同时实现pTW-A/S质粒的消除和下一轮基因整合过程中质粒与打靶片段的转入。利用该方法基因敲除/整合效率高达100%。通过对菌株BP01基因Bspan D与asp A进行高效连续整合,构建得到菌株BP03,成功提升产物β-丙氨酸的产量。【结论】建立起一种新的高效、方便、灵活的CRISPR/Cas9介导的大肠杆菌基因组连续编辑策略。通过这种不同温度敏感程度的多种质粒协同使用方法,一方面解决了传统方法中质粒消除繁琐等问题,另一方面也避免了大质粒多片段连接等步骤,并极大地缩短了实验周期,为代谢工程菌株改造提供有力工具。 相似文献
22.
【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。 相似文献
23.
本文通过116例二尖瓣决窄分离术中监护和输液,从中体会到术中监护是心脏手术成功必不可少的条件。只有做好术中监护,才能及时了解病情发展,正确指导复苏和输液,提高手术的安全系数。 相似文献
24.
【背景】细胞焦亡是一种细胞程序性死亡。在古菌和细菌中,gasdermin同源蛋白(GSDM)能够被特定的活化caspase (protease)酶切,从而激活类似于细胞焦亡的效应,产生细胞破碎效果。【目的】合成生物学、代谢工程和生物制造等应用过程中,细胞破碎是不可或缺的一步。利用细胞焦亡法破碎细胞取代传统的破碎方法,可以简化操作、提高生产效益。【方法】在大肠杆菌(Escherichia coli) BW25113中共表达protease和不同来源的GSDM,选择有明显细胞焦亡效应即来源Runella sp.的GSDM进行蛋白截短改造,使其在诱导表达蛋白截短体GSDMJD后能直接激活细胞焦亡效应。对GSDMJD进行过表达优化,获得可控大肠杆菌细胞焦亡菌株。进一步以重组表达蔗糖磷酸化酶为研究模型,验证本系统应用于细胞破碎释放蛋白的效果。【结果】实现了大肠杆菌中细胞焦亡的人为可控。焦亡菌株在诱导表达焦亡相关蛋白2 h后大肠杆菌细胞破碎死亡,内容物释放。将上述系统和超声法应用于制备蔗糖磷酸化酶粗酶液,细胞焦亡法制备的粗酶液的相对酶活显著高于超声法制备的粗酶液。在制备粗酶液的菌液OD600值为2.0时,细胞焦亡法制备的粗酶液相对酶活最高并且相较于超声法制备粗酶液,提高了60%的相对酶活。【结论】细胞焦亡提供了一种更加简单快捷、绿色环保的微生物细胞破碎方式,为合成生物学与代谢工程的发展奠定了基础。 相似文献
25.
蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)毒的化学组成和生物活性 总被引:1,自引:0,他引:1
系统分析少棘蜈蚣粗毒的化学组成,蛋白质含量86.23%、水不溶物质0.24%、还原糖0.23%、水份2.1%,仅含Ser、Pro、Arg等三种游离氨基酸,鉴定了11种微量元素,碱性凝胶电泳显示20条蛋白质谱带。分析了10种酶的活性、出血毒性及对血小板聚集的影响,其中精氨酸酯酶活力最高,不存在类凝血酶、淀粉酶活性及出血毒性,蜈蚣毒的浓度为0.3μg/μL时强烈诱导血小板的聚集。 相似文献
26.
高比例棉粕饲料中补充蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹摄食、生长及抗氧化酶活性的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
以40%棉粕为主的混合蛋白源制成基础饲料, 分别在其中添加0.00%、0.14%、0.28%、0.42%、0.56%蛋氨酸(分别记为0.00%Met、0.14%Met、0.28%Met、0.42%Met和0.56%Met), 配制了5种等氮等能的试验饲料, 以全鱼粉组(64.4%鱼粉)作为对照, 探讨了在高比例棉粕饲料中补充蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹(0.390.02) g的摄食率、生长率和机体抗氧化酶活性的影响。结果表明: 与全鱼粉对照组相比, 0.42%Met组的增重率、特定生长率和饲料系数均无显著差异(P0.05), 但其显著高于0.00%Met、0.14%Met和0.28%Met组(P0.05); 增重率和特定生长率则显著高于0.56%Met组(P0.05); 从幼蟹的摄食量和蛋白质沉积率来看, 0.42%Met和0.28%Met组的摄食量与对照组相似, 当蛋氨酸的补充量低于0.28%或高于0.42%时, 幼蟹的摄食量均有所下降; 统计表明, 对照组的蛋白质沉积率最高(23.20%), 在各试验组中, 0.28%Met和0.42%Met组之间的蛋白质沉积率无显著差异(P0.05), 但显著高于0.00%Met、0.14%Met和0.56%Met组(P0.05); 分析幼蟹的肠道胰蛋白酶活性, 发现0.42%Met组与对照组之间无显著性差异(P0.05), 但均显著高于其他各试验组(P0.05); 0.28%Met、0.42%Met和0.56%Met处理组的血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽过氧化物酶活性与对照组无显著差异(P0.05)。结果提示, 在高比例植物蛋白(40%棉粕)的基础饲料中, 补充0.42%Met能够显著提高中华绒螯蟹幼蟹的生长率、消化率和抗氧化酶的活性。
相似文献
27.
以大肠杆菌作为嘧啶核糖核苷水解酶(pyrimidine-specific ribonucleoside hydrolase RihA,RihA)表达宿主,利用生物转化的方法将尿苷高效转化为尿嘧啶。首先构建pET22b-RihA质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达,研究尿苷的转化情况。采用优化pET22b-RihA质粒信号肽和与分子伴侣质粒共表达两种策略进一步提高大肠杆菌转化尿苷的效率。来源于碱性磷酸酶的PhoA信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株F在投底物发酵时转化效果最好,当底物浓度为65 g/L转化15 h时,菌株F几乎将尿苷完全转化,尿苷转化率达到98.9%,而原始菌株A的尿苷转化率仅为80.2%。进一步对菌株F转化尿苷的浓度进行优化,投入一倍体积的尿苷底物后继续培养约53 h尿苷转化完全,得到尿嘧啶产量为73.45 g/L,尿嘧啶产率为98.16%。发酵液上清中RihA酶活最高的为PelB信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株C,其RihA酶活是原始菌株A的10.0倍。其中总可溶性RihA酶活最高的为PhoA信号肽和分子伴侣DnaK-DnaJ-... 相似文献
28.
为了研究雌雄异株植物构树(Broussonetia papyrifera(L.) Vent.)的性别差异,以其叶片为材料,采用石蜡切片法,对其主要解剖结构特征进行观察和比较。结果显示:(1)构树雌、雄株叶片解剖结构组成一致,均由表皮、叶肉组织和叶脉3部分组成。其上、下表皮均由一层细胞构成,具有较厚的角质层及丰富的表皮毛,叶肉中栅栏组织高度发达,此外,维管系统在叶中所占比例很大;(2)构树雌、雄株叶片细胞大小及厚度在各类型组织间存在一定差异,雄株叶片上表皮厚度、栅栏组织厚度、主脉维管束木质部厚度及维管束厚度均显著大于雌株叶片,且在栅海比、组织结构紧密度、组织结构疏松度和主脉维管束木质部面积占维管束的比例等方面也与雌株有极显著差异。研究结果表明构树叶片的解剖结构不仅具有旱生植物叶片的典型特征,而且还表现出明显的性别差异,这可能与构树雌、雄株的生殖分配有关。 相似文献
29.
空心莲子草茎的解剖结构对不同水湿生境的适应研究 总被引:34,自引:1,他引:34
研究了空心莲子草茎的解剖结构对水分变化的适应,这些空心莲子草生活在因水分差异而形成的3种生境类型中。对茎表蜡质层厚度、髓腔面积/髓部面积、厚角细胞层数、厚角细胞壁厚、韧皮纤维束数、韧皮纤维壁厚、导管束数、导管腔大小8个结构参数的分析结果表明:茎的全部结构参数随水分条件的变化都有显著或极显著的差异,其趋异程度的大小顺序是,导管腔大小>厚角细胞壁厚>蜡质层厚度>髓腔面积/髓面积>韧皮纤维细胞壁厚>韧皮纤维束数>厚角细胞层数>导管束数;水分变化对机械组织细胞壁结构影响较大,而对细胞数量的影响较小;茎的结构在旱生生境中变异较大,保证了它对不均一环境的适应;空心莲子草茎的结构既具有旱生性特点又具有水生性特点,其结构究竟朝哪个方向发展,取决于环境水分条件。从茎的结构上看,治理该种应以限制其导管腔和髓腔分化为主要手段。 相似文献
30.
碱性果胶酶高产菌株产酶条件的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:对碱性果胶酶高产菌株的产酶条件进行优化.方法:通过筛选得到一株产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)TCCC11286,利用单因素实验对其发酵条件进行优化.采用Plackett-Burman(P-B)方法筛选出对产酶有重要影响的3个因素(豆饼粉、MgSO4以及FeSO4的添加量),并采用响应面试验设计(RSM)对重要闪素进行优化.结果:最适的产酶条件为:玉米粉4%,豆饼粉3.55%,MgSO40.034%,(NH4)2SO4 0.4%,磷酸盐0.05mol/L,FeSO40.013%.结论:优化后其产酶能力得到了明显的提高,酶活提高到14.82U/ml. 相似文献