转基因动物在生物制药工业中的应用

简要论述了转基因动物的概念、制作方法及应用领域,回顾了转基因动物技术的发展及现状,分析了转基因动物与克隆动物的区别.就转基因动物在制药工业和生物医药领域中的国内外研究与开发应用情况进行了阐述,同时展望了转基因动物制药的发展前景及对社会的影响.     

吡咯喹啉醌合成及生产工艺研究进展

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)是继烟酰胺和核黄素之后发现的第三类氧化还原酶辅因子,普遍存在于生物体中参与呼吸链电子传递,具有促进线粒体产生、清除自由基、增强细胞代谢和预防心肌损伤等生理功能,在医药、食品和农业领域具有广泛的应用前景。微生物发酵法是PQQ生产的主要方式,解析PQQ生物合成途径及其调控机制,通过代谢工程选育短周期、高产量的生产菌是PQQ工业化的研究方向之一。本文综述了PQQ的合成途径、高产菌株选育以及微生物发酵生产与分离纯化的研发工作,为深入阐释PQQ的生物合成机制和工业化生产菌株的选育提供参考。     

大豆过氧化物酶在毕赤酵母中功能表达

【目的】大豆过氧化物酶(SBP)作用底物广泛、比活高、热稳定性好,使其在免疫检测、工业污染废水处理领域有着广泛的应用潜力。现有的生产方法主要是从大豆壳中提取,这种方法产量低,成本高,远不能满足于工业应用要求,本研究希望实现在毕赤酵母中高效表达有功能活性的大豆过氧化物酶。【方法】将大豆过氧化物酶基因以及C末端截短20个氨基酸的基因克隆pPIC-9K载体中,并在毕赤酵母X-33中诱导表达。同时还将糖基化位点的天冬酰胺突变成为谷氨酰胺,研究糖基化位点对表达的影响。【结果】全长SBP在毕赤酵母中表达是无活性的,只有截短的SBP△20在试管发酵的表达活力达23.5 U/mL,经过糖基化位点的突变表明130、144、185、197对酶活非常重要,不能突变;211和216位点去糖基化突变对酶活有所提高。【结论】经过发酵条件的优化,在5 L的发酵罐中发酵液上清最高酶活力达510 U/mL,是目前报道的最高水平。     

一种大肠杆菌快速连续CRISPR基因组编辑的新策略

【背景】通过CRISPR结合λ-Red同源重组技术进行染色体编辑是大肠杆菌遗传改造的重要手段。虽然目前已经有多个以CRISPR为基础的大肠杆菌基因组编辑策略,但这些方法往往涉及单独质粒消除、多片段组装等过程,存在效率低、操作繁琐、耗时长等问题。【目的】建立一种基于不同温度敏感程度的多种质粒协同使用的大肠杆菌快速、连续、高效的CRISPR基因组编辑方法,提高CRISPR在大肠杆菌基因编辑过程中的效率。【方法】将传统CRISPR方法中使用的pTarget质粒改造为RK2ts型温敏型质粒,并采用pTW-A/S两种抗性标记质粒交替使用的方法消除假阳性,实现质粒消除与下一步基因组编辑同步进行。【结果】在相同温度下RK2ts型质粒先于pSC101ts型质粒发生丢失,从而能够选择性缺失RK2ts型质粒pTW-A/S。同时实现pTW-A/S质粒的消除和下一轮基因整合过程中质粒与打靶片段的转入。利用该方法基因敲除/整合效率高达100%。通过对菌株BP01基因Bspan D与asp A进行高效连续整合,构建得到菌株BP03,成功提升产物β-丙氨酸的产量。【结论】建立起一种新的高效、方便、灵活的CRISPR/Cas9介导的大肠杆菌基因组连续编辑策略。通过这种不同温度敏感程度的多种质粒协同使用方法,一方面解决了传统方法中质粒消除繁琐等问题,另一方面也避免了大质粒多片段连接等步骤,并极大地缩短了实验周期,为代谢工程菌株改造提供有力工具。     

孕期应激对子代大鼠骨髓淋巴干细胞发育的影响

孕期应激对子代产生的影响是多方面的,这种影响是复杂的。研究表明,出生前的应激经历可导致出生后子代长期的免疫功能改变。这些改变追其根源与骨髓淋巴干细胞的改变有关。本文综述了大鼠孕期经历应激的子代骨髓淋巴干细胞所受的影响及免疫系统的相关改变,并根据现有的研究提出假说,为进一步研究孕期应激导致子代免疫系统改变的机理研究提供新的思路。     

鼻咽癌恶性转化基因Tx核苷酸序列分析

从人类鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA文库中克隆一个恶性转化基因Tx转染小鼠JB6 + 细胞 ,使细胞恶性转化 ,宿主细胞具有停泊非依赖生长的特性 .已经报道的Tx中一个 3 0kb片段(Tx3 0 )的序列分析结果表明 ,Tx包含人类免疫球蛋白κ轻链完整的J区 .进一步对Tx全长进行亚克隆和测序 ,并采用生物信息学方法进行分析表明 ,Tx包含人类Igκ完整的J区、C区基因片段、还有 5个重组信号序列 ,1个核基质结合序列和 1个N segment的插入 .Tx与正常人IgκJ、C区比较只是在某些位点存在碱基的缺失、插入或置换 ,二者同源性高达 98% ,其电子定位于 2p11 2 ,这与人Igκ的染色体定位是一致的 .可以认为 ,Tx是一个缺乏V区的异常的人类免疫球蛋白kappa轻链基因     

应用基因敲除快速构建大肠杆菌突变体改造脂肪酸代谢途径

【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。     

里氏木霉RutC30常温常压等离子体（ARTP）诱变筛选pyr4基因缺陷型菌株及转化系统的建立

以里氏木霉Trichoderma reesei重要工业生产菌RutC30为出发菌株,通过等离子体（ARTP）诱变筛选,以5-氟乳清酸（5-FOA）和尿苷（Uridine）进行筛选,获得一株pyr4基因缺陷株RutC30ΔU3。用含有野生型里氏木霉pyr4基因的互补质粒转化突变株,可回复野生性状。经测序发现其pyr4基因在核酸序列多个位点发生突变,其中包括两个错义突变和一个移码突变,从而导致乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶失活。经遗传稳定性研究分析,传代5次后仍保持良好的尿苷依赖性、去葡萄糖阻遏以及高产纤维素酶特性。经实验筛选获得了pyr4基因缺陷菌株可作为基因表达系统的受体菌株,建立了以尿苷营养缺陷为筛选标记的木霉转化系统。     

利用CRISPR-Cas9技术失活黑曲霉中果胶酶基因及突变株性能评价*

我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案。构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具。首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株AnΔpyrG,并在AnΔpyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系。利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50%,AnΔ4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化。在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础。