基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的本科教学实验体系的创建与实践

CRISPR/Cas9是新兴的基因编辑技术,在生命科学研究中发挥着重要的作用。将它引入本科生的实验教学,使本科生了解这项前沿科研技术很有意义。我们创建了一个基于CRISPR/ Cas9技术的本科教学实验体系。该实验体系侧重CRISPR/Cas9技术在哺乳动物细胞中的应用,选用一株基因组上被插入mCherry基因的小鼠胚胎成纤维细胞为实验材料,命名为STO-82。首先设计靶向mCherry的sgRNA,构建CRISPR-Cas9/sgRNA共表达质粒。经测序验证无误后,转染到STO-82细胞。采用流式细胞仪分析检测mCherry阴性和阳性两群细胞,分选出阴性单细胞并扩大培养。最后用测序检验单克隆细胞中靶标DNA序列的编辑情况。结果显示,靶位点有插入或缺失突变,说明体系创建成功。该实验体系将sgRNA设计、CRISPR-Cas9/sgRNA共表达质粒的构建、细胞转染、单细胞分选、单克隆细胞培养、测序序列分析等内容融合为一个综合实验,用于高年级本科生的实验教学。根据实际情况,将教学实践内容分解分块教学,也可以做完整性项目教学。本教学实践采用10人左右的小班分块教学,2人一组,经过3个班（共13组）的实践,绝大部分学生都能完成实验,得到预期结果。通过这个实验,学生加深了对CRISPR/Cas9技术的原理和实验流程的理解,锻炼了实验操作能力和严谨的科研思维,也使学生对该技术的医疗应用风险有了一些认识。     

网隔栽培法对生姜姜瘟病防治及产量的影响

姜瘟病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种细菌性病害,被称为生姜种植产业的“癌症”.本试验设计了一种“网隔栽培法”,并探索其对土传姜瘟病发病率和生姜产量的影响.结果表明,经过连续3年的田间验证,相比传统栽培法,“网隔栽培法”种植可显著降低姜瘟病的发病率,平均减少了6.08个百分点,平均防治效果达到了48.33%;同时,生姜产量平均增加了13.21%.这种“短行播种、纵横开沟、深沟隔病”的“网隔栽培法”为姜瘟病的绿色防控提供了新方案,也为其他蔬菜、中药材等植物的土传病害防治提供了新的借鉴思路.     

人脐带间充质干细胞通过分泌IL-6介导冈田酸对SH-SY5Y细胞毒性的保护作用

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种国际公认的难治性神经退行性疾病,是引起痴呆的最常见的病因.其主要的病理学变化是由Aβ过度沉积引起的老年斑(SP),以及Tau蛋白过度磷酸化引起的神经纤维缠结(NFTs).从人脐带华通胶中分离出的间充质干细胞(hUC-MSCs)由于其强大的旁分泌作用,已经被证实对神经系统疾病有治疗效果,其中包括AD,这种治疗机制尚不明确.本研究用冈田酸对SH-SY5Y细胞系进行损伤,建立AD体外模型,然后用种有hUC-MSCs的transwell小室或其条件培养基对模型进行治疗,并发现其分泌的IL-6可能是介导这种修复作用的关键因子.     

紫色马铃薯花青素StAN1基因的克隆及功能分析

MYB是植物花青素合成代谢途径中最主要的转录因子。该研究以紫色马铃薯B-5为试验材料,通过同源克隆技术,克隆了马铃薯花青素StAN1基因,并对StAN1基因的表达、遗传转化及其转基因烟草的花青素含量进行分析。结果表明:(1)StAN1基因全长774bp,编码了258个氨基酸;系统进化树分析发现,StAN1与辣椒、茄子、芦竹的亲缘关系最近,与矮牵牛、苹果等的亲缘关系最远。(2)荧光定量PCR分析显示,StAN1基因在马铃薯不同组织均有表达,其表达量从小到大依次为:根叶茎匍匐茎薯皮薯肉。(3)成功构建了表达载体pJAM1502-AN1,并经农杆菌(Gv3101)转化获得根、茎、叶片及叶脉均为紫红色的转StAN1基因烟草,PCR鉴定表明目的基因StAN1已成功转入烟草中。(4)花青素含量分析表明,野生型烟草叶片中花青素含量为2mg/g,叶片颜色为绿色,而转StAN1基因烟草叶片花青素含量达20mg/g,叶片颜色变成了紫红色。     

杜鹃花TPS基因家族鉴定及与萜类物质代谢的关系分析

萜烯合成酶（terpene synthase,TPS）能催化不同的前体物质生成不同的萜类化合物,是合成萜类物质的关键酶。为探究杜鹃花TPS基因家族成员在萜类物质代谢过程中的表达模式,本文基于杜鹃花基因组数据库,利用生物信息学方法对杜鹃花TPS基因（TPS）进行家族成员鉴定;通过云锦杜鹃和诺娃杜鹃两种不同种高山杜鹃的转录组测序结果,结合qRT-PCR、顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术,分析两种杜鹃不同发育时期花瓣中TPS家族成员表达水平和代谢物含量变化关系。结果表明,从杜鹃花基因组数据库中共鉴定获得47个RsTPS成员,RsTPS家族成员长度在591-2 634 bp之间,含有3-12个外显子不等,编码196-877个氨基酸;RsTPS家族成员主要分布在叶绿体和细胞质;系统进化分析结果显示RsTPS基因分为5个亚组。通过分析转录组数据得到7个功能注释为TPS的基因家族成员,发现TPS1、TPS10、TPS12和TPS13的表达量在4个时期中呈现出先上升,到盛开期达到顶峰后再下降的趋势。对基因表达量变化与萜类物质含量变化进行相关性分析,发现TPS1、TPS4、TPS9、TPS10、TPS12和TPS13表达量与云锦杜鹃不同时期花瓣中萜类物质含量变化呈显著性正相关,推测这6个基因家族成员可能是参与云锦杜鹃花香调控的关键基因。     

结构方程混合模型在SNP分析中的应用

采用结构方程混合模型(SEMM)对实际SNP数据进行分析,为遗传统计学提供一种新的有效的分析方法。本研究的数据是由GAW17提供的,包含697个个体的22条常染色体的上万个SNP和根据这些SNP所模拟的697个个体的性状特点。随机挑选了1号染色体上的4个SNP和3个定量性状作为研究变量,分别进行潜在类别分析和结构方程混合模型分析。根据4个SNP数据,人群被分为3个潜在类别,概率分别为0.53,0.34,0.13。潜在类别1、2和3中的因子均值Q分别为-4.029、-2.052和0,潜在类别1、2的因子均值均低于3(<0.001)。研究表明:结构方程混合模型(SEMM)综合了结构方程模型和潜在类别模型的思想,形成了自己的优势,可用于处理同时包含分类潜变量和连续潜变量的数据。     

贵州四个山羊品种mtDNA多态性及起源分化

采用１５种限制性内切酶,研究贵州省４个山羊品种共９３只个体的线粒体ＤＮＡ多态性。其中ＢｏｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ３种酶的酶切类型存在多态。共检测到１８种限制性态型,归结为３种ｍｔＤＮＡ单倍型。单倍型Ⅰ、Ⅱ在贵州山羊４个品种分布频率较高,分别为７７．４２％和２１．５０％,单倍型Ⅲ分布频率较低（１．０８％）;品种间亲缘关系聚类分析表明白山羊和黑山羊亲缘关系最近,其次为黔林羊,而与小香羊的亲缘关系最     

肾素 - 血管紧张素 - 醛固酮系统阻滞的研究进展

肾素-血管紧张素-醛固酮系统起初被认为是较简单的神经体液调节机制之一。但是,这一想法随着RAAS阻滞剂:肾素阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、AT1受体拮抗剂及盐皮质激素受体拮抗剂的深入研究而受到挑战。因此,RAAS的组成、以上药物发挥作用的具体通路及副作用均得到重新定义。在RAAS阻滞剂的应用过程中,机体肾素水平升高,并刺激肾素原受体(即无活性的肾素前体,PRR),进而对机体造成不良影响。同理,在AT1受体拮抗剂的应用过程中,血浆血管紧张素II的水平升高,并与2型血管紧张素II(AT2)受体结合,进而对机体产生有利作用。此外,随着ACEI及ARB的应用,血管紧张素1-7水平升高,其与Mas受体结合,发挥心脏及肾脏保护的作用,还可通过刺激干细胞发挥组织修复作用。     

多模式磁共振指导超时间窗急性缺血性卒中的静脉溶栓治疗研究

目的:评价多模式磁共振指导下超时间窗静脉应用重组组织型纤溶酶原激活剂rt PA治疗急性缺血性卒中的疗效及安全性。方法:将68例急性脑梗塞患者分为rt PA静脉溶栓组A组、强化抗栓治疗组B组,各组按药物干预时间再分为4.5小时亚组及4.5-6小时亚组。A组给予rt PA静脉溶栓治疗和常规治疗,B组给予首剂氯吡格雷300毫克+阿司匹林100毫克和常规治疗。治疗前行急诊头多模式磁共振检查,治疗24小时后复查头CT,分别于治疗前后不同时间点进行NIHSS评分和3个月MRS评分,记录不良事件的发生情况。结果:A组两个亚组治疗后各时间点NIHSS评分均明显低于B组,且A组4.5小时亚组治疗后NIHSS评分低于其4.5-6小时亚组,A组3个月预后良好患者比例显著高于B组,差异均有统计学意义(P0.05)。A组症状性颅内出血的发生率高于B组。结论:多模式头磁共振指导下超时间窗rt PA静脉溶栓治疗安全有效,远期疗效优于强化抗栓治疗,但颅内症状性出血风险略高于强化抗栓治疗。