重组HBsAg的纯化及动物免疫原性研究

用乙型肝炎病毒(HBV)DNA转染工程细胞株MT-5,收获培养上清液,经超过滤浓缩、PEG沉淀和3次超速离心,得到纯化的HBsAg。经SDS-PAGE银染色后,纯化的HBsAg显示两条多肽,分子量分别为23k和27k,与血源HBsAg的多肽成分相同,为HBsAg的两条特异性多肽。经PAGE银染色结果显示,纯化的HBsAg中杂蛋白含量符合疫苗制备要求。用上述方法提纯HBsAg,回收率可达44.1％以上。 将纯化的HBsAg吸附于氢氧化铝佐剂,免疫Balb/c小鼠,并与血源HBsAg对照,抗体半数阳转剂量(ED50)分别为0.501μg和0.832μg,说明基因工程HBsAg的免疫原性似优于血源HBsAg。     

密度梯度区带离心大量提纯乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的研究

文献上通常用于大量制备纯HBsAg的方法为两次氯化铯等比重分带和一次蔗糖速率区带沉降法。但在我们实验中,此法似乎不太理想,因为所得的HBsAg通常含有极微量的正常人血清蛋白。我们采用了一种复合的纯化方法,它包括胃蛋白酶消化、DEAE纤维素层析,氯化铯浮升区带离心及蔗糖速率区带离心。此法可以制出纯HBsAg,其浮密度在氯化铯梯度中为1．1 9—1．23克／厘米’,在蔗糖梯度中为1．15—1．16克／厘米’。在纯化的HEsAg 中未测出正常人血清蛋白,给豚鼠及马匹免疫3—4次可产生单特异抗一lIBs血清,不舍抗正常人抗体,因此纯度较高。电子显微镜观察,可见均匀的小球形颗粒,未见Dane颗粒及杆状颗粒。     

亲和层析法在免疫学中的应用

在免疫学研究中,很早就开始将抗原-抗体反应的特异性用于提纯抗原或抗体。其方法是先使抗原与抗体在液相中可逆结合成为免疫沉淀物,洗涤除去不反应的杂质,然后改变条件使它们解离以获得纯净的抗体或抗原。解离的方法有稀酸法、稀碱法、浓盐法、增温法等四类。     

3′-末端标记法制备乙型肝炎病毒(HBV)直接重复序列(DR)的生物素化的寡核苷酸探针

本文首次报告用3’—末端核苷酸转移酶将生物素—11—dUTP标记到人工合成的21寡核苷酸上,该d(NMP)_(21)与HBV DNA长链缺口区附近的序列互补,并含HBV DNA的直接重复序列(Direct Repeat)。本文对其标记条件、检出方法进行观察比较,找出合适的条件,制成的生物素化d(NMP)_(21)探针可与标准的HBVDNA进行杂交,检测敏感度为25pg。用这种探针可以从乙型肝炎病人血清中检出HBV DNA。