125I和65Zn在大蟾蜍体内的吸收与分布

利用同位素示踪法研究了不同引入途径的125I和65Zn在大蟾蜍体内的吸收与分布。无论采用注射还是灌喂的方法,蟾蜍对125I的残留动态差别不大,都可分为快清除期和平台期,0～2d为快清除期,3～7d为平台期,经过了快清除期之后,残留的125I约为起始量的8%,并维持到实验结束。注射了65Zn后,0～7d的吸收动态曲线有所起伏,但波动很小,其波动范围为102.4%～114.48%。表明大部分的65Zn仍留在体内,几乎没有排出体外。注射65Zn的转移并不明显。但灌喂65Zn的动态变化则大些,而且转移明显。其活度曲线出现阶段性下降,有两个下降期,第一个下降期为4h～3d,第二个下降期为5～7d。说明灌喂组对65Zn的转移比注射组的活跃,但在实验的第7d残留率仍在60%以上。     

微细胞介导人14号染色体自A9细胞转移至DT40细胞

为了获得含人14号染色体的DT40细胞,用于人抗体基因的表达研究.本研究利用微细胞介导的染色体转移技术,将A9细胞中的人14号染色体转移至DT40细胞中.首先,摸索秋水仙胺诱导A9细胞微核形成最佳浓度与最佳时间,以终浓度为10 mg/mL的细胞松驰素B破坏细胞骨架,离心分离微细胞,获得的微细胞依次经8μm、5μm、3μm滤膜过滤后与受体细胞DT40融合,细胞铺板后加入G418筛选.然后,对长出的抗性克隆进行基因组DNA检测及FISH杂交,分析人14号染色体在DT40杂合细胞克隆中的存在情况.结果显示,成功获得含人14号染色体的DT40(#14)细胞,三轮试验共获得抗性克隆30个,人14号染色体有效转移率为1×10-6.实验结果表明,人14号染色体完整的自A9细胞转移至DT40细胞,获得的DT40(#14)细胞可用于制备含人抗体基因的人类人工染色体,用于人抗体基因的表达研究.     

解淀粉芽胞杆菌关键酶基因过表达对鸟苷积累的影响

【目的】研究鸟苷生物合成途径中的3个关键酶编码基因(prs,purF,guaB)过表达对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵生产鸟苷的影响。【方法】利用穿梭表达载体PBE43,构建含有prs、purF和guaB基因的单独表达载体和prs、purF基因的串联表达载体,将它们分别转入鸟苷生产菌B.amyloliquefaciens TA208后,通过实时定量PCR测定各工程菌株内相关基因的转录水平;通过酶活检测分析关键酶基因扩增对肌苷酸脱氢酶活性的影响;通过摇瓶发酵实验考察工程菌株与对照菌株的生长、耗糖和鸟苷积累情况。【结果】转录分析结果表明prs、purF和guaB基因过表达的同时都伴随着自身转录水平的显著上调。与此同时,prs和purF基因单独表达均轻微下调了嘌呤操纵子的转录水平,但是guaB基因的过表达并不影响嘌呤操纵子和prs基因的转录。酶活分析结果表明prs和purF基因扩增并不影响肌苷酸脱氢酶的活性,guaB基因的扩增使其活性提高了126%。摇瓶发酵实验发现prs和purF基因的单独过表达均未促进宿主菌合成鸟苷,而含guaB基因过表达载体的工程菌鸟苷产量较出发菌株提高20.7%。将prs和purF基因串联表达后,鸟苷产量提高14.4%,糖苷转化率增加6.8%。【结论】过表达guaB基因能够大幅提高鸟苷产量,而prs和purF基因只有实现协同表达才能对宿主菌积累鸟苷产生积极影响,为通过代谢工程技术提高鸟苷产量奠定了研究基础。     

分枝杆菌噬菌体重组系统及其应用

噬菌体是微生物遗传学研究的有力工具及源泉.分枝杆菌噬菌体也是构建分枝杆菌,尤其是结核分枝杆菌遗传研究工具的基础.目前,基于分枝杆菌噬菌体重组酶的重组系统是国际热点.总结了近年来基于分枝杆菌噬菌体Che9c重组酶gp60、gp61所构建的分枝杆菌重组工程体系及其在分枝杆菌基因组研究方面的应用,并结合实验室工作展望了其研究前景.该体系不依赖细菌自身的RecA系统,不需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶,不需要复杂的体外操作,只需表达分枝杆菌噬菌体重组酶,从而使结核分枝杆菌基因敲除、基因敲入及点突变和构建分枝杆菌噬菌体突变株更方便.这为分枝杆菌及其噬菌体基因诱变及基因功能研究提供了迅捷的新途径.     

不同碳源生物转化合成L-亮氨酸的代谢计量分析

目的:建立黄色短杆菌利用不同碳源生物合成L-亮氨酸的代谢网络模型,并进行代谢网络计量分析.方法:通过对所构建的L-亮氨酸代谢网络模型进行途径分析,确定以果糖、葡萄糖、蔗糖或木糖为碳源时L-亮氨酸生物合成的基元模型、最大理论产率和不同模型的呼吸熵.结果:通过途径分析得到了L-亮氨酸生物合成的基元模型.以果糖、葡萄糖、蔗糖和木糖为碳源时L-亮氨酸的最大理论产率均为66.7%,其对应的最大呼吸熵分别为18、16、19、18.结论:L-亮氨酸理论得率与碳源种类无关;呼吸熵增加,能够有效提高L-亮氨酸合成代谢流,限制菌体量的过量生成.与其他碳源相比,蔗糖能够避免碳架溢流出现,合成L-亮氨酸能量代谢需求低;而葡萄糖能够较好地满足菌体生长和产酸的需求.     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因遗传变异特性研究

为了解北京地区人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）的遗传变异和分子流行病学特征,首次对北京地区2003～2004年63株HRSV分离株进行了G基因3’末端的第2个高度变异区的序列测定,并进行了基因分型和遗传变异的分析。使用不同的型特异性引物对GPA—F1和GPB-F1分别扩增A、B血清型HRSVG基因3’末端核苷酸序列,特异性扩增产物和随后的序列测定结果均显示,北京地区2003～2004年63株HRSV毒株中,96．8％（61／63）为A血清型,3．2％（2／63）为B血清型,说明北京地区在2003～2004年间存在HRSVA、B血清型共循环,但以A血清型病毒为主。分别对北京流行的A和B血清型病毒进行了基因亲缘性关系分析,结果提示,61株北京A血清型分离株全部为GA2基因型;2株B血清型分离株为GB3基因型。由此看来,GA2基因型是北京地区2003～2004年的优势流行基因型。北京61株GA2分离株之问核苷酸和氨基酸同源性分别在87．8％～100％和77．9％～100％之间;2株B血清型分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为94．7％和88．1％。这说明在2003年和2004年有很多个不同的GA2基因型HRSV毒株在北京地区共循环,北京地区的HRSV流行存在着许多由不同病毒株引起的传播链。B血清型分离株Beijing04-11于G基因3’末端含有一个60个碱基的重复序列,这是HRSV多聚酶易于重复复制限定序列的一个极端的例子,有可能是HRSV逃逸免疫压力而不断进化的一种方式。该研究首次对北京地区2003年和2004年流行的HRSV进行了基因分型和遗传变异的研究,对于了解北京HRSV流行株的基因特征具有重要意义,可以为北京乃至中国疫苗株的选择提供参考依据,从而指导HRSV的免疫预防控制。     

磁选育浸矿菌种新方法的研究——磁泳分离菌种

世界无处不有磁,磁场对整个世界产生着重大的影响。本文通过大量镜检工作,观察到从酸性矿坑水中初步分离培养得到的部分细菌对外加磁场均有微弱的趋磁性。基于菌种的这种特性,设计了磁泳装置用不同的磁场梯度分离细菌,磁泳分离的方法可以初步分离出近磁、远磁茼,这两个菌群的生理特性有着很大的差异,主要体现在其对亚铁氧化和对金属高于的浸出上,远磁菌亚铁氧化活性比近磁菌高将近50％,远磁菌对铜离子的浸出效果也比近磁茼好。近磁菌在强磁性矿物培养基中生长情况较好,而远磁茼在弱磁性矿物培养基中生长情况较好。而且,在近磁茼的纯培养茼体中分离到磁性颗粒。实验结果证明。采用磁泳用于分离体内舍有磁性颗粒的细菌是可行并且有效的,这一分离技术和工艺的结合也将大大促进我国生物冶金的步伐。     

磁选育浸矿菌种新方法的研究--磁泳分离菌种

世界无处不有磁,磁场对整个世界产生着重大的影响。本文通过大量镜检工作,观察到从酸性矿坑水中初步分离培养得到的部分细菌对外加磁场均有微弱的趋磁性。基于菌种的这种特性,设计了磁泳装置用不同的磁场梯度分离细菌,磁泳分离的方法可以初步分离出近磁、远磁菌,这两个菌群的生理特性有着很大的差异,主要体现在其对亚铁氧化和对金属离子的浸出上,远磁菌亚铁氧化活性比近磁菌高将近50%,远磁菌对铜离子的浸出效果也比近磁菌好。近磁菌在强磁性矿物培养基中生长情况较好,而远磁菌在弱磁性矿物培养基中生长情况较好。而且,在近磁菌的纯培养菌体中分离到磁性颗粒。实验结果证明,采用磁泳用于分离体内含有磁性颗粒的细菌是可行并且有效的,这一分离技术和工艺的结合也将大大促进我国生物冶金的步伐。     

一类新广谱抗生素药物靶标--异柠檬酸裂合酶的生物学研究

乙醛酸循环是一个重要的能量代谢途径,普遍存在于微生物体内,它在微生物致病过程中发挥了至关重要的作用。异柠檬酸裂合酶作为乙醛酸循环的第一个关键酶,是理想的抗感染药物靶标．了解该酶的基本结构性质、生物学功能及其分子生物学进展将有助于新型抗菌药物的开发。     

天然产物活性成分新型结晶纯化技术初探

鉴于天然产物中活性成分含量低,结晶性组分易堵塞管道等问题,本文以30％穿心莲内酯浸膏原料为例,通过超临界CO2萃取结晶技术来提高穿心莲内酯晶体的含量。结果发现：在温度55℃,时间90min,流量15L／min时,当萃取结晶压力超过20MPa后,穿心莲内酯的纯度超过80％,并采用HPLC分析实验结果。新型超临界CO2萃取结晶技术为开发高纯天然产物活性成分提供一条捷径。