渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了不同磷浓度时渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明,不同磷含量时,产甘油假丝酵母甘油合成越多,分泌至胞外和积累于胞内的甘油也越多,其最大甘油合成量存在一个最适渗透压。同样;在相同渗透压下,其最大甘油合成量也存在一个最适磷浓度。在相同磷含量时,渗透压增高能够促进胞内聚磷酸盐积累;当渗透压相同时,培养基中磷含量增加,胞内游离磷和聚磷酸盐均增加。在生长稳定期后期,富磷可以促进胞内游离磷和聚磷酸盐积累显著增加。经分析发现,产甘油假丝酵母胞内积累甘油与聚磷酸盐,可能对克服对数生长期细胞数量少而渗透压胁迫大的困境发挥了极其重要的作用,从而能维持其生长稳定期较高的生物量、细胞存活率和甘油产量。     

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌的构建

利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli )中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS_PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为43 kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yqh-D的基因工程菌进行表达研究表明：37 ℃,以1.0 mmol /L IPTG诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到120 u/mg蛋白,而对照菌株的酶活力为0.5 u/mg蛋白。再将含甘油脱水酶基因dhaB和含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的重组质粒共转化大肠杆菌JM109得到重组大肠杆菌JM109（pUCtac-dhaB, pEtac-yqhD）,该菌株在好氧条件下,以1.0mmol/L IPTG诱导可将50 g/L甘油转化为38.0 g/L 1,3-丙二醇。首次发现1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶在好氧条件下表现出较高的活性。     

生淀粉糖化酶的结构和作用机理

较详细地介绍了生淀粉糖化酶的形式,结构（亲合位点和催化位点）和作用机理（与生淀粉亲合方式和催化）。     

在无天然游离质粒产甘油假丝酵母中非整合表达合成咖啡酸

【背景】咖啡酸（3,4-二羟基肉桂酸）是一种有多种生物活性和药用价值的天然酚类化合物,产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）具有咖啡酸前体代谢途径,高耐酸且生长与发酵速率快,是潜在高产咖啡酸的底盘细胞,但无游离载体将影响咖啡酸合成的深入研究。【目的】探索在无天然游离质粒的C. glycerinogenes中构建操作更简便、表达能力更强的游离载体合成咖啡酸的可行性。【方法】筛选自主复制序列（autonomously replicating sequence,ARS）,构建适用于C. glycerinogenes合成咖啡酸的游离载体,并通过改造其ARS位置、标记基因URA5启动子长度、基因表达元件和利用Kozak序列优化表达并合成咖啡酸。【结果】构建的5个分别含不同ARS的载体中,pTGAPU-CA-AOX1t-KLARS在C. glycerinogenes中能自我复制并表达合成咖啡酸的基因,而且当ARS位于目的基因表达元件上游、URA5启动子截短250 bp,或分别采用Kozak序列与终止子URA5t后,咖啡酸产量较改造前均有明显提升,最高产量为初始产量的3.73倍,达29.1 mg/L,高于前期整合表达产量。【结论】在C. glycerinogenes中非整合表达合成咖啡酸且优于整合表达,为今后利用游离载体改造咖啡酸合成代谢途径提供了新工具,同时为其他无游离质粒菌株构建非整合表达体系提供参考。     

一种米曲霉蛋白酶的酶学性质及其在酪蛋白磷酸肽制备中的应用

【目的】分离纯化米曲霉蛋白酶的主要组分,分析其酶学特性,并应用于酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopeptides,CPPs)的制备。【方法】采用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和Butyl-sepharose HP疏水层析对米曲霉蛋白酶进行分离纯化,SDS-PAGE检测分子量与纯度,MALDI-TOF-MS检测酶切位点。【结果】得到一种蛋白酶组分(命名为PE),分子量大小为58 kD左右。该酶最适反应条件为55 °C,pH 8.0,酶活被Fe3+抑制,被Mn2+激活。以酪蛋白为底物时,Km=0.36 g/L,最大反应速率Vm=18.18 mg/(L?min)。蛋白酶PE对牛胰岛素B链上-Leu-Cys-、-Val-Glu-、-Tyr-Leu-和-Arg-Gly-组成的肽键有较高的切割能力,酶切位点较多。利用其水解酪蛋白,通过钡-乙醇沉淀法得到CPPs,产率为15.87%,摩尔氮磷比r (N/P)为6.17,得到的CPPs可以使钙沉淀推迟35 min。【结论】利用米曲霉蛋白酶水解酪蛋白产生CPPs,为其在功能性食品加工方面的应用提供有利的参考。     

产甘油假丝酵母HOG途径应答研究进展

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是工业甘油生产菌株,具有多重高抗逆、生长迅速、糖代谢高效等优点,是优良的工业宿主菌株.高渗甘油(high osmolarity glycerol, HOG)应答途径是真核细胞应答高渗透压胁迫的关键响应机制.本文从产甘油酵母HOG途径的生物信息学分析、MAP激酶Hog1对细胞表型、甘油转运和合成、氨基酸的合成与转运调控进行阐述,为进一步理解该酵母的HOG应答途径和抗逆机制奠定了基础.     

乙酸钠、烟酸对红曲菌白色变种产Monacolin K的影响

[背景]红曲是由红曲菌寄生在大米发酵而成的一种食用米曲,含有胆固醇抑制剂Monacolin K,但市售红曲中酸式Monacolin K含量低且普遍呈红色,其应用存在局限性.红曲菌白色变种3001-18具有不产色素和桔霉素而高产酸式Monacolin K的优点.[目的]研究微量营养物对红曲菌固态发酵Monacolin K...     

代谢改造克雷伯氏菌合成D-1,2,4-丁三醇

【背景】D-1,2,4-丁三醇(D-1,2,4-butanetriol,BT)是一种重要的四碳多元醇,应用范围广,以木糖为底物的四步生化反应是目前最高效的BT生物合成路线。但大肠杆菌宿主存在严重的碳代谢抑制,限制了工程菌在木糖葡萄糖混合糖下的生长和BT合成。然而克雷伯氏菌具有生长速度更快、葡萄糖木糖混合糖利用效果好等优点。【目的】在碳代谢抑制效应较弱的克雷伯氏菌中构建以木糖为底物的BT合成途径,以提高混合糖下BT合成能力。【方法】将来源于Clostridium crescenti的木糖脱氢酶基因xdh和来源于Lactococcus lactis的2-酮异戊酸脱羧酶基因kivD及来源于Escherichia coli W3110的木糖酸脱水酶基因yjhG克隆至KlebsiellapneumoniaeZG25,得到重组菌K.pneumoniae ZG25-BT,对重组菌进行培养条件和培养基优化,进一步敲除xylA以提高BT产量。【结果】在37°C、200 r/min、接种量1%、诱导时间2 h、添加10.0 g/L CaCO3控制pH条件下,敲除xylA的重组菌在1.5倍LB培养基中以30.0 g/L木糖和10.0 g/L葡萄糖为底物,BT的产量达到4.52 g/L,摩尔转化率为0.21mol/mol,收率为15%,较优化前分别提高150%、62%和67%。【结论】实现了BT在K.pneumoniaeZG25中的发酵生产,同时通过培养条件和培养基的优化及xylA的敲除提高了BT合成能力,为进一步实验奠定了基础。     

新型渗透压调控的工业酵母启动子

摘要:【目的】筛选工业酵母Candida glycerinogenes渗透压调控性能优越的启动子,为工业酵母改造及转基因研究提供新途径。【方法】PCR扩增C. glycerinogenes新型系列启动子PCgPGI、PCgTPI、PCgZWF、PCgSTL1、PCgSTL2、PCgSTL3,利用生物信息学技术解析启动子序列中渗透压胁迫应答元件,构建包含gfp荧光蛋白报告基因和PCgPGI、PCgTPI、PCgZWF、PCgSTL1、PCgSTL2、PCgSTL3启动子的5.8S rDNA整合表达载体,通过荧光强度及mRNA转录的qRT-PCR测定结果检验各启动子活性强度及其受渗透压调控情况。【结果】启动子PCgSTL3包含多个STRE渗透压胁迫应答元件,在工业酵母中受渗透压调控更敏感,启动强烈,转录水平高,gfp表达量大。【结论】PCgSTL3是受渗透压调控能够实现外源基因可控表达的优良工业酵母启动子。     

Candida glycerinogenes不同碳源代谢的初步研究

研究了不同碳源对Candidaglycerinogenes的菌体生长、发酵液pH值及代谢产物的影响,结果发现以葡萄糖、果糖等单糖为碳源时茵体生长较快,最终生物量比以蔗糖、麦芽糖等二糖为碳源时高20％～30％;导致发酵前12h发酵液pH值明显下降的主要因素是乳酸;与葡萄糖为碳源转化为甘油相比,果糖为碳源时更易累积乙醇;以蔗糖、麦芽糖为碳源时,用于转化生成甘油的碳源明显降低,碳源主要用于茵体自身生物合成及HMP途径,以蔗糖为碳源时,用于乳酸、丙酸及柠檬酸生物合成的碳源较麦芽糖明显提高,TCA途径代谢较为活跃。