产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌的构建

利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli )中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS_PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为43 kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yqh-D的基因工程菌进行表达研究表明：37 ℃,以1.0 mmol /L IPTG诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到120 u/mg蛋白,而对照菌株的酶活力为0.5 u/mg蛋白。再将含甘油脱水酶基因dhaB和含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的重组质粒共转化大肠杆菌JM109得到重组大肠杆菌JM109（pUCtac-dhaB, pEtac-yqhD）,该菌株在好氧条件下,以1.0mmol/L IPTG诱导可将50 g/L甘油转化为38.0 g/L 1,3-丙二醇。首次发现1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶在好氧条件下表现出较高的活性。     

渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了不同磷浓度时渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明,不同磷含量时,产甘油假丝酵母甘油合成越多,分泌至胞外和积累于胞内的甘油也越多,其最大甘油合成量存在一个最适渗透压。同样;在相同渗透压下,其最大甘油合成量也存在一个最适磷浓度。在相同磷含量时,渗透压增高能够促进胞内聚磷酸盐积累;当渗透压相同时,培养基中磷含量增加,胞内游离磷和聚磷酸盐均增加。在生长稳定期后期,富磷可以促进胞内游离磷和聚磷酸盐积累显著增加。经分析发现,产甘油假丝酵母胞内积累甘油与聚磷酸盐,可能对克服对数生长期细胞数量少而渗透压胁迫大的困境发挥了极其重要的作用,从而能维持其生长稳定期较高的生物量、细胞存活率和甘油产量。     

生淀粉糖化酶的结构和作用机理

较详细地介绍了生淀粉糖化酶的形式,结构（亲合位点和催化位点）和作用机理（与生淀粉亲合方式和催化）。     

在无天然游离质粒产甘油假丝酵母中非整合表达合成咖啡酸

【背景】咖啡酸（3,4-二羟基肉桂酸）是一种有多种生物活性和药用价值的天然酚类化合物,产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）具有咖啡酸前体代谢途径,高耐酸且生长与发酵速率快,是潜在高产咖啡酸的底盘细胞,但无游离载体将影响咖啡酸合成的深入研究。【目的】探索在无天然游离质粒的C. glycerinogenes中构建操作更简便、表达能力更强的游离载体合成咖啡酸的可行性。【方法】筛选自主复制序列（autonomously replicating sequence,ARS）,构建适用于C. glycerinogenes合成咖啡酸的游离载体,并通过改造其ARS位置、标记基因URA5启动子长度、基因表达元件和利用Kozak序列优化表达并合成咖啡酸。【结果】构建的5个分别含不同ARS的载体中,pTGAPU-CA-AOX1t-KLARS在C. glycerinogenes中能自我复制并表达合成咖啡酸的基因,而且当ARS位于目的基因表达元件上游、URA5启动子截短250 bp,或分别采用Kozak序列与终止子URA5t后,咖啡酸产量较改造前均有明显提升,最高产量为初始产量的3.73倍,达29.1 mg/L,高于前期整合表达产量。【结论】在C. glycerinogenes中非整合表达合成咖啡酸且优于整合表达,为今后利用游离载体改造咖啡酸合成代谢途径提供了新工具,同时为其他无游离质粒菌株构建非整合表达体系提供参考。     

产甘油假丝酵母HOG途径应答研究进展

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是工业甘油生产菌株,具有多重高抗逆、生长迅速、糖代谢高效等优点,是优良的工业宿主菌株.高渗甘油(high osmolarity glycerol, HOG)应答途径是真核细胞应答高渗透压胁迫的关键响应机制.本文从产甘油酵母HOG途径的生物信息学分析、MAP激酶Hog1对细胞表型、甘油转运和合成、氨基酸的合成与转运调控进行阐述,为进一步理解该酵母的HOG应答途径和抗逆机制奠定了基础.     

乙酸钠、烟酸对红曲菌白色变种产Monacolin K的影响

[背景]红曲是由红曲菌寄生在大米发酵而成的一种食用米曲,含有胆固醇抑制剂Monacolin K,但市售红曲中酸式Monacolin K含量低且普遍呈红色,其应用存在局限性.红曲菌白色变种3001-18具有不产色素和桔霉素而高产酸式Monacolin K的优点.[目的]研究微量营养物对红曲菌固态发酵Monacolin K...     

产1，3-丙二醇重组大肠杆菌JM109（pEtac—dhaB—tac—yqhD）的构建

在生物柴油的生产过程中,最高可得到约10％的副产物甘油,副产物甘油的去向将成为生物柴油大规模产业化发展所面临的严峻问题。以生物柴油副产物甘油为原料耦合生产1,3-丙二醇,不仅解决了生物柴油副产物甘油的出路问题,同时降低了1,3-丙二醇的生产成本。本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏茵的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用表达载体pEtac串联构建了重组质粒pEtac—dhaB—tac—yqhD,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109（pEtac—dhaB-tac—yqhD）,降低了代谢中间产物3-羟基丙醛的积累,提高了1,3-丙二醇的产量。     

耐高温厨余垃圾降解菌的分离、驯化与应用

为提高厨余垃圾减量效率,从不同来源的垃圾样品中分离筛选高效耐高温降解菌株应用于厨余垃圾降解。经平板涂布和划线分离法筛选共获得18株耐高温菌株,进一步利用平板透明圈法考察菌株对淀粉、蛋白、脂肪和纤维素的降解能力,最终获得4株耐高温强降解能力的菌株;经形态学和分子生物学鉴定,菌株分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)和嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum);为进一步提高厨余垃圾减量性能,以厨余垃圾浸出液作为培养基,对菌株进行定向驯化并制备复合菌剂,应用于厨余垃圾处理器,48 h后厨余垃圾质量减少了73.8%,与对照组相比,质量减少率分别提高约10%和35.1%。本研究利用厨余垃圾浸出液对筛选获得的菌株进行驯化和制备培养,不仅提高了菌剂降解活性,而且实现了废弃物的资源化利用。     

利用温控载体构建碱性果胶酯裂解酶工程菌

从筛选出的Bacillus subtilisWSHB04-02菌株中扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入载体pET22b( )多克隆位点,得到带有前导序列PelB重组质粒pET22b( )PL。以pET22b( )PL为模板扩增出带前导序列的碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入温控载体pHsh,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。其表达量与以T7为启动子的重组菌BL21DE3[(pET22b( )PL]相比,表达量相近。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量均为43kDa,同核酸序列测定所推导的值相符。研究表明利用pHsh构建的JM109(pHsh PL)诱导表达好,诱导方式简单廉价,这对该酶的大规模发酵具有重要意义。     

溶氧对Candida glycerinogenes产甘油发酵过程的影响

研究了溶氧浓度对产甘油假丝酵母分批发酵生产甘油过程的影响。实验结果表明：当溶氧浓度控制在30%时,C. glycerinogenes的甘油产量、得率和产率达到最高,分别为120.7 g/L、0.575 g/g和1.69 g/(L•h),而糖酵解代谢副产物形成最少。当溶氧浓度为10%时,发酵过程呈现出“巴斯德效应”的特征,生成的酵解代谢副产物维持在较高水平。在快速生长阶段,随着溶氧从10%增加到60%,细胞呼吸类型表现为从厌氧呼吸向好氧呼吸转变,酵解代谢副产物依次减少。在生长稳定期,控制的溶氧浓度越高,酵解代谢副产物乙醇、乙酸等的生成减少。分别选用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-like方程,能较好地模拟细胞生长、甘油合成和葡萄糖消耗的动力学过程。