一株以甘油为底物产二羟丙酮(DHA)微生物菌种的筛选及鉴定

甘油为微生物可利用的理想碳源,从自然界筛选出21株以甘油为唯一碳源产二羟丙酮（DHA）的菌株,经初步发酵测定发酵液中DHA含量,其中菌株6-8DHA产量最高达6.4g／L。对其进行常规生理生化鉴定实验,并结合16S rDNA基因分析,比对结果表明,菌株6-8与Acinetobacter sp.相似性最高,达99．7％,在细菌分类学上属于假单胞茵目莫拉茵科不动杆菌属。将其命名为Acinetobactersp.6-8。     

过量表达钝齿棒杆菌柠檬酸合酶编码基因prpC2对L-精氨酸合成的影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。柠檬酸合酶作为TCA途径的关键酶,对细胞胞内氨基酸代谢流调节有重要作用。在钝齿棒杆菌SYPA5-5中过量表达同源的柠檬酸合酶(citrate synthase)基因prp C2,研究其对精氨酸及副产物合成的影响。重组菌C.crenatum SYPA5-5/p DXW-10-prp C2胞内柠檬酸合酶比酶活提高了5.37倍,使L-精氨酸产量在5L发酵罐中达到44.7g/L,与对照相比提高了23.1%。同时,有机酸测定分析TCA循环的精氨酸前体柠檬酸及异柠檬酸的量有所提高,且赖氨酸合成前体草酰乙酸量减少,氨基酸测定分析L-精氨酸发酵中最主要的副产物L-赖氨酸浓度由原来的5.96g/L降到1.21g/L,降低了80%。     

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)染色体倍性分析

摘要：【目的】产甘油假丝酵母作为一株优良高产甘油菌株,已成功应用于工业生产15年。近年来由于产甘油假丝酵母染色体倍性尚不明确,限制了对其进行遗传改造的研究进展,因而我们对产甘油假丝酵母染色体倍性研究,分析确定其染色体倍性。【方法】选用酿酒酵母细胞进行生孢,制备酿酒酵母单倍体细胞作对照,并选用热带假丝酵母作为二倍体酵母细胞对照,利用血球计数板得到热带假丝酵母、产甘油假丝酵母、单倍体及二倍体酿酒酵母细胞数,提取染色体,通过二苯胺检测法测定DNA含量。由于在相同紫外照射条件下单倍体细胞比二倍体细胞更容易死亡,因     

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子

[目的]克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性.[方法]采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp.将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp.通过电击转化酿酒酵母W303-lA.将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测.[结果]重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强.[结论]PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义.     

啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对啤酒风味稳定性的影响

以pUG6为模板, 设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物, 构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒, 转化啤酒酵母G-03, 获得一株G-03/a转化菌, 遗传稳定性良好, 测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)分泌量在对数生长期分别比原菌高21.4%和14.7%。在锥形瓶中连续发酵4代后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1%和13.8%, 发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7%和5.3%, 成品啤酒RSV值提高45.0%。EBC管发酵6 d后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0%。转化菌G-03/a与G-03所酿制成品啤酒的常规指标没有显著差别。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母, 能够提高啤酒的风味稳定性。     

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵

N-乙酰鸟氨酸转氨酶 (EC 2.6.1.11,ACOAT) 是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum精氨酸合成途径中的第4个酶,催化底物N-乙酰谷氨酸半醛生成产物N-乙酰鸟氨酸。为研究N-乙酰鸟氨酸转氨酶在钝齿棒杆菌中精氨酸合成中的作用,考察其酶学性质,对培养基成分和发酵过程工艺条件的优化提高精氨酸产量提供依据。从精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体扩增获得ACOAT编码基因argD,全长1 176 bp,编码390个氨基酸,在Escherichia coli BL21(D     

TCA循环关键节点对L-谷氨酸合成的影响

谷氨酸是一种重要的氨基酸,其衍生出来的高值化产品具有广泛的应用,市场需求量巨大。文中通过对出发菌株谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum E01和谷氨酸高产菌C. glutamicum G01进行转录组测序与重测序分析,挑选中心代谢途径中转录水平和基因水平上存在差异的基因进行研究,以挖掘出对谷氨酸合成影响较大的基因进一步提高谷氨酸的产量。草酰乙酸节点和α-酮戊二酸节点在谷氨酸合成中扮演着重要角色,探索研究了草酰乙酸节点和α-酮戊二酸节点对谷氨酸生产的扰动影响。综合以上实验结果构建的整合菌株,5 L发酵罐发酵过程中其菌体生长速率较原始菌略有降低,但48h的谷氨酸产量高达(136.09±5.53)g/L,较原始菌的(93.53±4.52)g/L提高了45.5%;糖酸转化率提高至58.9%,较原始菌的45.2%提高了13.7%。可见,上述实验策略的应用在一定程度上提高了谷氨酸产量和糖酸转化率,为谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造提供了理论基础。     

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。【方法】利用硫酸铵盐析,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化,SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量,采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2,分子质量分别约为37 kD和45 kD。以酪蛋白为底物时,P1的Km=8.36 g/L,Vm=12.95μg/(mL·min),最适反应条件为pH 8.0、45°C;P2的Km=4.11 g/L,Vm=4.86μg/(mL·min),最适反应条件为pH 7.0、45°C。两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低。P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。【结论】两种蛋白酶的酶学性质存在差异;两者对疏水氨基酸构成的肽键具有选择性,但其作用基团存在特异性。这些研究结果将为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。     

β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶共表达一步法催化乳糖到塔格糖

[目的]构建一株以廉价原料乳糖为底物合成塔格糖的重组菌株,实现一步法高效生物合成稀有糖——塔格糖.[方法]从Escherichia coli K-12基因组中,PCR扩增出阿拉伯糖异构酶araA和β-半乳糖苷酶lacZ基因,以SD-AS为连接子,利用pET28a-1载体串联表达于Escherichia coli BL2...     

在无天然游离质粒产甘油假丝酵母中非整合表达合成咖啡酸

【背景】咖啡酸（3,4-二羟基肉桂酸）是一种有多种生物活性和药用价值的天然酚类化合物,产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）具有咖啡酸前体代谢途径,高耐酸且生长与发酵速率快,是潜在高产咖啡酸的底盘细胞,但无游离载体将影响咖啡酸合成的深入研究。【目的】探索在无天然游离质粒的C. glycerinogenes中构建操作更简便、表达能力更强的游离载体合成咖啡酸的可行性。【方法】筛选自主复制序列（autonomously replicating sequence,ARS）,构建适用于C. glycerinogenes合成咖啡酸的游离载体,并通过改造其ARS位置、标记基因URA5启动子长度、基因表达元件和利用Kozak序列优化表达并合成咖啡酸。【结果】构建的5个分别含不同ARS的载体中,pTGAPU-CA-AOX1t-KLARS在C. glycerinogenes中能自我复制并表达合成咖啡酸的基因,而且当ARS位于目的基因表达元件上游、URA5启动子截短250 bp,或分别采用Kozak序列与终止子URA5t后,咖啡酸产量较改造前均有明显提升,最高产量为初始产量的3.73倍,达29.1 mg/L,高于前期整合表达产量。【结论】在C. glycerinogenes中非整合表达合成咖啡酸且优于整合表达,为今后利用游离载体改造咖啡酸合成代谢途径提供了新工具,同时为其他无游离质粒菌株构建非整合表达体系提供参考。