钝齿棒杆菌中异源表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶合成L-鸟氨酸的研究

目的:对一株产鸟氨酸的钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5/△proB/△argF(SYPO-1)进行代谢工程改造,筛选不同细菌来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在大肠杆菌中克隆与表达,纯化后对其进行酶学性质的比较;将黏质沙雷氏菌Serratia marcescens Y213来源的Smarg E基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在L-鸟氨酸生产菌株C.crenatum SYPO-1中过量表达,进一步提高L-鸟氨酸的产量。方法:通过利用pDXW10穿梭质粒对不同来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰化酶进行克隆表达和酶学性质比较,选择性质最优来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶编码基因Smarg E在产L-鸟氨酸重组钝齿棒杆菌中表达,考察重组菌株发酵过程中参数的变化。结果:来源于S.marcescens Y213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶比酶活最高为798.98U/mg,最适pH为7,最适温度为37℃,0.1mmol/L的Mg~(2+)、Li~+、Mn~(2+)促进酶的比酶活提高了50%;在钝齿棒杆菌中表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶酶活达到128.4U/ml,显著提高了钝齿棒杆菌中胞内乙酰基循环水平;5L发酵罐发酵重组菌株96h,L-鸟氨酸的产量达到38.5g/L,比出发菌株,L-鸟氨酸的产量提高了33.2%,产率达0.401g/(L·h)。结论:筛选出最佳来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶,在鸟氨酸生产菌株C.crenatum(SYPO-1)中过量表达,可以促进鸟氨酸的前体物质N-乙酰鸟氨酸的快速消耗,实现鸟氨酸的积累。     

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择HindIII进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD600≈1.3时收集细胞,在1.5kV电压下,感受态细胞浓度为2.0×109个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μgDNA的较高转化率,58%的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。     

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。【方法】利用硫酸铵盐析,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化,SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量,采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2,分子质量分别约为37 kD和45 kD。以酪蛋白为底物时,P1的Km=8.36 g/L,Vm=12.95μg/(mL·min),最适反应条件为pH 8.0、45°C;P2的Km=4.11 g/L,Vm=4.86μg/(mL·min),最适反应条件为pH 7.0、45°C。两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低。P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。【结论】两种蛋白酶的酶学性质存在差异;两者对疏水氨基酸构成的肽键具有选择性,但其作用基团存在特异性。这些研究结果将为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。     

温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响

【目的】研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcecens JNB5-1)在不同发酵温度(28℃和37℃)条件下蛋白质组的差异表达,探究粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度调控的原因。【方法】利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOF-MS)分离和鉴定粘质沙雷氏菌在不同发酵温度(28℃和37℃)条件下的差异蛋白;再利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进一步分析挑选出的七个差异蛋白编码基因的转录水平。【结果】2-DE图谱显示,共鉴定到16个显著差异的蛋白点。其中,灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶(PigF)、氧化还原酶(PigN)和参与灵菌红素前体物质(脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、二辛烯醛和丙二酰-CoA等)代谢的相关蛋白(酶)的表达量在37℃条件下都出现极显著的下降;热休克蛋白(Hsp60)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)等应急性蛋白在37℃条件下表达上调。通过RT-qPCR证实,氧甲基转移酶、氧化还原酶和转酮醇酶基因(transketolase)在37℃条件下的转录水平均低于28℃条件下的。【结论】S.marcecens JNB5-1在相对低温(28℃)条件下产灵菌红素,相对高温(37℃)条件下不产灵菌红素。可能是高温(37℃)显著抑制了灵菌红素合成相关酶的表达。     

鲁氏酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）在粉状毕赤酵母中的表达

为探索在野生型粉状毕赤酵母（Pichia farinosa）中整合表达来源于耐高渗鲁氏酵母（Zygosacharomyces rouxii）的3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）以提高产甘油能力的可行性,应用PCR方法从P. farinosa的染色体中扩增出乳清苷酸脱羧酶基因（URA3）片段,以此作为同源整合的靶序列,构建了整合型表达载体pUR-ZG。电击转化粉状毕赤酵母,以抗生素Zeocin为筛选标记,获得转化子pfa-gu,摇瓶发酵结果表明：以P. farinosa作为对照菌株,发酵72h后,转化子pfa-gu的生物量和甘油含量均高于对照菌株,其中甘油含量达到37g/L,比对照提高了30%。结论：在P. farinosa中异源表达ZrGPD1能够提高细胞的产甘油能力和对渗透压的调节能力。     

TCA循环关键节点对L-谷氨酸合成的影响

谷氨酸是一种重要的氨基酸,其衍生出来的高值化产品具有广泛的应用,市场需求量巨大。文中通过对出发菌株谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum E01和谷氨酸高产菌C. glutamicum G01进行转录组测序与重测序分析,挑选中心代谢途径中转录水平和基因水平上存在差异的基因进行研究,以挖掘出对谷氨酸合成影响较大的基因进一步提高谷氨酸的产量。草酰乙酸节点和α-酮戊二酸节点在谷氨酸合成中扮演着重要角色,探索研究了草酰乙酸节点和α-酮戊二酸节点对谷氨酸生产的扰动影响。综合以上实验结果构建的整合菌株,5 L发酵罐发酵过程中其菌体生长速率较原始菌略有降低,但48h的谷氨酸产量高达(136.09±5.53)g/L,较原始菌的(93.53±4.52)g/L提高了45.5%;糖酸转化率提高至58.9%,较原始菌的45.2%提高了13.7%。可见,上述实验策略的应用在一定程度上提高了谷氨酸产量和糖酸转化率,为谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造提供了理论基础。     

米黑根毛霉来源l-天冬酰胺酶的分子改造及高效表达

l-天冬酰胺酶能够水解l-天冬酰胺生成l-天冬氨酸和氨,广泛存在于微生物、植物和部分啮齿类动物的血清中,在医药和食品行业中都具有重要应用。然而无论是在医药还是在食品行业中,l-天冬酰胺酶依然存在一些问题,如催化效率低、热稳定性差、产量低等。文中通过理性设计及5′非翻译区 (5′ untranslated region, 5′ UTR)改造提高米黑根毛霉Rhizomucor miehei来源的l-天冬酰胺酶 (RmAsnase) 的酶活及蛋白表达量。结果显示,通过同源建模结合序列比对分析构建的6个突变菌株中,突变酶A344E比酶活较野生酶提高了1.5倍。继而构建食品安全菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-A344E,对其进行UTR改造,获得重组菌株B. subtilis 168/pMA5 UTR-A344E,其酶活较原始菌提高了7.2倍,对重组菌B. subtilis 168/pMA5 UTR-A344E进行5 L罐研究,最终产量为489.1 U/mL。该酶活提高的重组菌株对l-天冬酰胺酶的工业化应用具有重要价值。     

代谢工程改造大肠杆菌合成羟基酪醇

羟基酪醇是重要精细化学品,作为天然抗氧化剂被广泛应用于食品、医药领域。利用合成生物学技术生产羟基酪醇具有重要意义。本文克隆并功能鉴定了来源于大肠杆菌Escherichia coli BL21的羟化酶编码基因HpaBC,结果表明该酶的两个亚基均能成功表达并能催化酪醇生成羟基酪醇。通过CRISPR-Cas9技术将由tac启动子调控的HpaBC基因表达盒整合到前期构建的酪醇高产菌株YMG5A*R基因组中,同时删除副产物乙酸的合成途径,获得大肠杆菌代谢工程菌株YMGRD1H1。摇瓶发酵实验结果表明,重组菌株能够直接利用葡萄糖生产羟基酪醇,产量达到1.81 g/L,同时发现几乎没有副产物积累。5 L发酵罐规模的流加补料发酵实验表明,羟基酪醇最高产量达到2.95 g/L,是目前文献报道以葡萄糖从头合成羟基酪醇的最高水平。通过系统改造大肠杆菌,实现了羟基酪醇的大量合成,为进一步构建具有工业应用潜力的羟基酪醇细胞工厂奠定了基础,也为拓展芳香族化合物的微生物制造路线提供了有益的参考。     

谷氨酸棒杆菌耐受胁迫机制及工业鲁棒性合成生物学研究进展

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum作为一般被认为具有生物安全性的一种模式工业微生物,不仅在发酵工业中成功用于大规模生产氨基酸,而且具有合成多种新型化学品的潜力。谷氨酸棒杆菌菌株在生产化合物时,经常会受到各种逆境条件的胁迫,从而降低细胞活力和生产性能。合成生物学的发展为提高谷氨酸棒杆菌的鲁棒性提供了新的技术手段。本文总结了谷氨酸棒杆菌应对发酵过程中各种胁迫的耐受机制。同时,重点介绍提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性和耐受性的合成生物学新策略,包括挖掘新的抗逆元件、改造转录调控因子、利用适应性进化策略挖掘抗逆功能模块等。最后,从生物传感器、转录调控因子的筛选和设计、多种调控元件利用等方面对提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性进行了展望。     

烟曲霉脯氨酰内肽酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达与重组酶性质

【目的】研究烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因的异源表达及重组酶性质。【方法】以烟曲霉CICIM F0044总RNA为模板,反转录合成cDNA;再以cDNA为模板,通过PCR扩增去除自身信号肽的脯氨酰内肽酶基因,构建表达载体pPIC9K-PEP;电转化酵母宿主菌Pichia pastoris GS115,获得重组菌PEP-09;纯化并分析重组酶性质。【结果】重组菌摇瓶发酵酶活力最高可达647.3 U/L。表达产物纯化后的分子量为63 kD左右。重组酶最适反应温度为65°C,有较好的温度稳定性,在55°C保温8 h能保留90%以上的酶活力。该酶最适pH为5.5,在pH 3.0 9.0范围内有很好稳定性,在pH 6.0 8.0的缓冲液中37°C保温10 d酶活没有明显变化。【结论】烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,重组酶活性稳定,有一定的应用潜力。