一株以甘油为底物产二羟丙酮(DHA)微生物菌种的筛选及鉴定

甘油为微生物可利用的理想碳源, 从自然界筛选出21株以甘油为唯一碳源产二羟丙酮(DHA)的菌株, 经初步发酵测定发酵液中DHA含量, 其中菌株6-8 DHA产量最高达6.4 g/L。对其进行常规生理生化鉴定实验, 并结合16S rDNA基因分析, 比对结果表明, 菌株6-8与Acinetobacter sp. 相似性最高, 达99.7%, 在细菌分类学上属于假单胞菌目莫拉菌科不动杆菌属。将其命名为Acinetobacter sp.6-8。     

酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达

利用PCR技术从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae W303-1A）总DNA中扩增得到1．9kb乙醛脱氢酶编码基因aldh,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac—aldh,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。对含有aldh的基因工程菌进行表达研究表明：该菌株在37℃下,以1．0mmol／LIPTG诱导5h酶活力达到22．8U,比酶活力为15．0U／mg蛋白,而对照菌株检测不到酶活力,并且该菌的耐乙醛浓度可达3．2g／L。     

一种来源于克劳氏芽孢杆菌的高碱性尿酸氧化酶的异源表达及重组酶性质分析

以碱性蛋白酶生产菌克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)基因组DNA为模板PCR扩增获得尿酸氧化酶基因(BcU),插入原核表达载体pET28α中,构建表达载体pET-BcU,并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-BcU。经IPTG诱导,重组菌BL21(DE3)/pET-BcU表达出有活性的尿酸氧化酶,含空质粒的重组菌在同样条件下没有酶活。酶学性质分析显示,重组酶最适pH值为9.0,在pH值9.0～11范围内酶活几乎不变,是一种高碱性尿酸氧化酶。     

产甘油假丝酵母HOG1 MAPK同源基因CgHOG1的克隆及特征分析

摘要:【目的】获得产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)耐高渗和过量合成甘油的关键调控基因—丝裂原活化蛋白激酶基因(CgHOG1),并考察其渗透压调节功能。【方法】运用简并PCR 结合Self-Formed Adaptor PCR技术从产甘油假丝酵母基因组中克隆CgHOG1基因并进行生物信息学相关分析,将CgHOG1基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)hog1Δ缺失突变株中互补表达,考察菌株耐渗透压能力变化。【结果】所获得CgHOG1基因全长1164 bp,编码387个氨基酸序列(GenBank No. KC480066);氨基酸序列与来源于Ogataea parapolymorpha的Hog1p同源性最高,为86%;该基因在酿酒酵母hog1Δ缺失突变株中异源表达能够显著提高菌株的抗盐耐高渗和甘油合成能力。【结论】本文所获得的基因CgHOG1是一个具有耐高渗和过量合成甘油调控功能的新基因,研究结果为产甘油假丝酵母超高渗应答机制的研究及抗盐耐旱作物改造提供了新的基因。     

超声波萃取烟叶中3-磷酸甘油脱氢酶的研究

将超声波萃取手段引入到烟叶中3-磷酸甘油脱氢酶提取方法中,并通过正交实验确定了超声波萃取烟叶中3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)的最佳条件为：超声波破碎功率为75w,超声波破碎间歇时间为2s,超声波破碎时间为3s,料液比为1:15g/mL;在此最佳条件下测得烟叶中3-磷酸甘油脱氢酶为0.3937U/mg蛋白,均比其他提取手段的酶活要高。     

产甘油假丝酵母TRP1基因的克隆与功能分析

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) WL2002-5 是我国发酵甘油生产菌种, 具有高产甘油和耐高渗透压的优良性能。本文采用遗传互补的方法从产甘油假丝酵母基因文库中克隆了TRP1基因(CgTRP1)。序列分析显示, 该基因编码区全长735 bp, 编码的磷酸核糖氨基苯甲酸同分异构酶(CgPRAI)氨基酸序列与其他酵母来源的PRAI蛋白同源性在32.9%~49.2%之间。功能互补实验显示, CgTRP1基因在高拷贝情况下可以互补酿酒酵母trp1基因功能但在低拷贝情况下只能部分互补酿酒酵母trp1基因功能, 是一条功能明确、结构完整的酵母新基因。在CgTRP1 基因下游发现另一蛋白编码基因, 编码的氨基酸序列与酵母无机焦磷酸酶有很高的相似性。     

高效降解棉酚菌株的分离鉴定及诱变选育

作为一种蛋白资源, 棉籽粕因其含有毒素——游离棉酚限制了其在饲料工业中的应用。为获得能高效降解棉籽粕中棉酚的菌株, 以醋酸棉酚为唯一碳源培养基从16份样品中筛选出一株高效降解棉酚菌株(Y-2), 经生理生化及18S rDNA鉴定为Pichia guilliermondii, 此菌种为非致病酵母, 且首次报道用于棉酚的降解, 在工业生产中具有潜在的应用前景。通过紫外诱变获得一株棉酚降解率更高的突变株YUV-51。通过对突变株YUV-51发酵温度、时间及接种量的初步优化, 获得其固态发酵优化条件: 30 °C培养48 h, 接种量0.025 g湿菌体/g棉籽粕, 初始水分含量50%。为避免游离棉酚在前处理中大量降解棉籽粕, 不进行湿热处理, 经接种发酵后脱毒率可达到58%。这使微生物脱毒在实际生产中应用成为可能。     

生淀粉糖化酶高产菌的选育

从土壤及霉变淀粉质等样品中分离出对生淀粉具有降解作用的菌种约 6 0株 ,其中生淀粉糖化酶最高的一株根霉OR-1 ,其酶活为 90U/mL ,通过一次紫外和亚硝基胍诱变 ,酶活分别达到 200U/mL、325U/mL ,RDA值分别为 70 %、 65%。诱变株是一株产生淀粉糖化酶较高的根霉。     

天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因 (ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行了异源表达,通过 Ni-NTA 亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经 SDS-PAGE 测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性质发现该酶最适温度35 ℃;最适pH 7.0,对酸性条件比较敏感。通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变。突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14%和10%。利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5 L罐发酵,结果表明：在麦芽糖浓度300 g/L、初始反应温度和pH分别为35 ℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3%,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700 g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98 g/L。     

多聚磷酸盐激酶双底物通道腔的理性设计及其在无细胞催化生产谷胱甘肽中的应用

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)是一种重要的辅助因子,参与许多需能的生物催化反应。多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinases,PPK)由于其底物聚磷酸盐廉价易得,可以为消耗ATP的反应提供能量。本研究选择哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)来源的ChPPK,进行了底物谱和耐受性分析,通过分子对接和定点突变,理性改造多聚磷酸盐激酶的双底物通道腔来提高PPK酶的催化活性。与野生型相比,筛选得到突变体ChPPK_K81H-K103V的相对酶活提高了326.7%,同时,双突变扩大了ChPPK的底物利用范围与耐受性,提高了该酶的耐热性与耐碱性。基于该ATP再生系统,本研究偶联谷胱甘肽双功能酶GshAB和ChPPK_K81H-K103V,破细胞后采用无细胞催化生产谷胱甘肽,加入5 mmol/L ATP后,该体系6 h可以生产(25.4±1.9) mmol/L的谷胱甘肽,比突变前的催化体系提高了41.9%。优化无细胞催化体系的缓冲液、裂解液菌体量、补料时间后,无细胞体系可产生(45.2±1.8) mmol/L谷胱甘肽,底物l-半胱氨酸的转化率达到90.4%。提高ChPPK生产ATP的能力,可有效增强底物的转化率,降低催化成本,实现了无细胞催化生产谷胱甘肽的高产量、高转化率与高经济价值的统一。本研究提供了一种绿色高效的ATP再生系统,可为消耗ATP的生物催化反应平台提供可持续动力。