用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达，降低肝细胞中胆汁酸的分泌

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02).根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野生型L-02细胞和仅转染pSicoR空载体的L-02细胞作对照,观察肝细胞胆固醇7α羟化酶的表达以及培养上清中总胆汁酸含量.利用半定量PCR、实时荧光定量PCR及Western-blot等实验方法检测了转染细胞中基因的干涉效果,结果显示:与对照组相比,在mRNA水平,转染慢病毒siRNA载体的L-02细胞,其胆固醇7α羟化酶基因的表达量仅为野生型L-02细胞表达量的31.2%,为转染pSicoR空载体的L-02细胞的34.1%,干涉效率分别为68.8%和65.9%,均具有显著差异(P＜0.05);Western-blot结果显示胆固醇7α羟化酶在蛋白质水平表达也明显受到抑制,表明转染慢病毒siRNA下调了肝细胞中胆固醇7α羟化酶基因的表达,减少了胆汁酸的分泌.以上研究结果表明,利用RNAi技术可以获得低表达胆固醇7α羟化酶基因的肝细胞,并有效降低肝细胞中胆汁酸的分泌,为临床上生物人工肝的构建及应用奠定基础.     

CTLA4基因修饰骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化及其免疫抑制功能研究

用携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stern cels,BMMSCs),体外向肝细胞诱导分化,并检测其免疫抑制功能.用含有HGF等细胞因子培养液诱导重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMMSCs向肝细胞分化.诱导后的细胞可表达AFP、Alb和CK18等肝细胞标志,同时还具有储存糖原和摄取、排泌靛青绿等肝细胞功能.转基因BMMSCs在未经诱导和诱导后均可表达CTLA4Ig,诱导14天时表达量有所减弱.单向混合淋巴细胞反应证实,诱导7天的转基因BMMSCs具有明显的抑制淋巴细胞反应的作用,其抑制作用明显高于未转基因BMMSCs,且CTLA4Ig基因修饰BMMSCs输注还可以明显延长肝移植大鼠的存活时间.用重组腺病毒Ad-CTLA4Ig对BMMSCs进行基因修饰,一方面不会影响BMMSCs的肝细胞分化潜能,另一方面使BMMSCs的免疫抑制特性得到进一步强化.     

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

基于小波分析与BP神经网络的西湖叶绿素a浓度预测模型

小波神经网络是基于小波分析理论所构造的一种分层的、多分辨率的新型人工神经网络。选择合适的小波基和分解尺度对西湖水体Chl—a进行小波分析,将原序列分解成一个低频概貌分量和多个高频细节分量,再通过BP网络建立西湖叶绿素a浓度短期预测模型Ⅰ和模型Ⅱ。模型Ⅰ将小波分析去除高频细节信息后的低频概貌部分作为输入变量预测Chl-a含量;模型Ⅱ则对低频部分和高频部分分别进行预测,最后汇总各分网络输出得到最终结果。对确证集预测时,模型Ⅰ的平均误差为4．4％,模型Ⅱ仅为1．9％,且误差范围较模型Ⅰ小,表明模型Ⅱ具有较高的预测精度和稳定性。最后运用模型Ⅱ进行水质预测,预测值与实际值的平均相对误差为6．4％,并选取3号点（中山码头）进行模型的泛化,平均相对误差为6．9％,取得了较理想的预测效果,说明小波神经网络能成功预测西湖水体中Chl—a含量的短期变化趋势,为西湖水质管理提供科学依据。     

人羊水来源干细胞的体外培养及其生物学性状分析

目的:体外分离培养人羊水来源干细胞(hAFSC),观察分析其基本的生物学性状。方法:取孕中期产前诊断所抽取的羊水,离心收集细胞,然后贴壁培养获得hAFSC。在细胞培养的基础上,观察hAFSC的形态;研究其增殖能力;用流式细胞术测定细胞周期及不同代次细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)表达率的变化;利用RT-PCR方法检测细胞干性基因的表达;利用诱导培养基诱导,检测其向肝样细胞与成骨细胞分化的潜能。结果:在体外培养条件下,hAFSC表现为成纤维细胞形态;具有良好的增殖能力,群体倍增时间约为36 h;细胞周期检测G0/G1期细胞约占86.7%,S+G2/M期细胞约占13.3%;流式细胞术检测结果表明,hAFSC表达SSEA-4,且SSEA-4阳性率随传代次数呈现先上升后下降的趋势;hAFSC在mRNA水平上表达Nanog、Oct4和Rex1等胚胎干细胞标志性基因;经诱导培养基诱导后,hAFSC可以向肝样细胞与成骨细胞分化。结论:hAFSC是一群呈成纤维细胞样,有良好增殖能力,且具有多向分化潜能的细胞,加之其来源方便,伦理学限制较少,因此在细胞治疗及组织工程等方面有着广泛的应用前景。     

胰岛素抵抗大鼠的肝脏中丝氨酸/酪氨酸磷酸化异常与血清TNF-α相关

目的探讨胰岛素抵抗大鼠胰岛素受体底物-1丝氨酸/酪氨酸磷酸化与肿瘤坏死因子α（TNF-α）的关系。方法雄性Wistar大鼠30只（体质量80-120 g）,随机分为普通饮食组（NC）及高脂饮食组（FH）2组,每组15只。喂养10周,以高胰岛素-正常血糖钳夹技术评估胰岛素抵抗大鼠模型。应用ELISA法检测大鼠血清TNF-α含量,Western Blot法检测肝脏组织中胰岛素受体底物-1丝氨酸磷酸化（IRS-1Ser636）及酪氨酸磷酸化（IRS-1Tyr465）表达。结果FH组葡萄糖输注率（GIR）60-120水平明显低于NC组[（1.56±0.43 vs.5.15±0.66）mg/（kg.min）,P〈0.01];FH组大鼠TNF-αI、RS-1Ser636均高于NC组[（15.43±2.16 vs.5.4±2.16）pg/mL,P〈0.01;（109.45±13.75 vs.94.23±15.05）,P〈0.05],IRS-1Tyr456水平低于NC组[（111.08±14.28 vs.125.77±14.51）,P〈0.05]。TNF-α水平与IRS-1Ser636呈正相关（r=0.503,P=0.024）,与IRS-1Tyr465呈负相关（r=-0.521,P=0.019）。结论胰岛素抵抗大鼠TNF-α水平与IRS-1Tyr465负相关,与IRS-1Ser636正相关,提示TNF-α引起胰岛素抵抗机制可能与IRS-1磷酸化异常有关。     

白细胞介素8 基因-251A/T 多态与子宫内膜异位症的相关性研究

目的:探讨白细胞介素8基因(IL-8)-251A/T多态性在子宫内膜异位症发生中的作用。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和焦磷酸测序方法,研究152例子宫内膜异位症患者和134例正常子宫内膜中IL-8基因-251A/T多态性的分布情况。结果:IL-8基因-251A/T多态位点的AA、AT和TT基因型在子宫内膜异位症组中分别为12.5%、46.1%、41.5%,等位基因A和T的频率分别为35.5%、64.5%;在对照组中AA、AT和TT三种基因型分布频率分别为24.6%、41.0%、34.3%,等位基因A和T的频率分别为45.1%、54.9%。IL-8基因-251A/T单核苷酸多态是子宫内膜异位症发病的独立的危险因素(P<0.05);A等位基因携带者患子宫内膜异位症的风险增高(P<0.05)。结论:在中国北方汉族人群中IL-8基因-251A/T单核苷酸多态性与子宫内膜异位症的发病具有相关性,A等位基因是子宫内膜异位症发病重要的遗传学标记。     

低温胁迫对不同基因型小麦品种光合性能的影响

选用不同基因型小麦品种(春性品种扬麦18、弱春性品种郑麦9023、半冬性品种烟农19),研究了分蘖期和拔节期低温对叶片光合和叶绿素荧光特性的影响.结果表明:分蘖期-10℃低温处理后,烟农19的净光合速率(Pn)、气孔导度(gs)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)和PSⅡ非循环光合电子传递速率(ETR)显著高于扬麦18和郑麦9023;郑麦9023的gs、Fv/Fm、qp和NPQ显著高于扬麦18,胞间CO2浓度(Ci)显著高于烟农19;扬麦18的Ci显著高于烟农19,初始荧光(Fo)显著高于郑麦9023和烟农19.拔节期0℃低温处理后,烟农19的Pn、gs、Fv/Fm和qP显著高于扬麦18和郑麦9023,NPQ和ETR显著高于扬麦18;郑麦9023的Pn、gs、Fv/Fm和qP显著高于扬麦18,Fo显著高于烟农19;扬麦18的Ci和Fo显著高于郑麦9023和烟农19.分蘖期和拔节期低温胁迫下,半冬性品种烟农19具有较高的光合活性和较强的自我保护机制,弱春性品种郑麦9023次之,春性品种扬麦18最低.     

人胎肝中低分子抑瘤物的分离纯化、结构鉴定及其对肿瘤细胞生长的选择性抑制作用

在胎儿组织中存在一类低分子肿瘤抑制物。胎肝细胞的甲醇－丙酮提取物中保留有大部分抑瘤活性。用体外液体培养条件下对人急性粒系白血病细胞系（ＨＬ－６０）的抑制作用为指标,跟踪指导分离过程。提取物经反相Ｃ１８中压液相色谱、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶色谱及氨基键合相高效液相色谱分离得到一纯活性物质,经ＮＭＲ和ＭＳ鉴定为７－酮基胆固醇（７－ｋｅｔｏｃｂｌｅｓｔｅｒｏｌ,７－ＫＣ）。体外琼脂培养条件下７－ＫＣ对小鼠ＷＥＨ１－３和Ｓ－１８０细胞较对正常小鼠骨髓粒一巨噬系祖细胞有更强的抑制增殖及集落生成作用。７－ＫＣ对ＨＬ－６０细胞增殖较对正常人骨髓ＣＦＵ－ＧＭ有更强的抑制作用。     

2004年新疆旧石器考古调查简报

2004年5-6月,中国科学院古脊椎动物与古人类研究所和新疆文物考古研究所联合组队,在新疆北部和中部进行了旧石器时代考古调查。发现24个石器地点和数千件石制品,采集和试掘出500余件石制品;绝大多数石制品来自于地表,少数出自原生地层。石制品类型多样,包括普通石核与石片、棱柱状石核、石叶、两面器、细石叶石核、细石叶、勒瓦娄哇石核与石片等;原料种类多样,尺寸、形态、技术变异大。从技术与类型判断,这些不同地点的文化材料时代跨度较大,较早的可能属旧石器时代晚期之初,甚至旧石器时代中期,较晚的则可能属于新石器时代早中期。较早阶段的石制品组合与中亚、西伯利亚阿尔泰地区同期遗址的文化面貌有相似之处,也与我国水洞沟遗址的石叶遗存有一定联系。骆驼石遗址及其丰富的勒瓦娄哇制品及大型石叶制品是本次调查的最大收获。本次调查的成果表明,新疆地区在旧石器时代晚期是人类迁徙和生存演化的活跃地带,留下丰富的文化遗存,对研究当时人类技术、文化特点和适应生存能力提供了重要材料与信息;很多地点具有与欧洲、俄罗斯阿尔泰地区旧石器时代中、晚期相似的文化遗存,对研究当时欧亚大陆古人群的迁徙、融合和文化交流具有重要价值;该地区具有发现更多、更重要的旧石器时代遗址并开展深入的考古发掘与研究的巨大潜力。