幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用初步纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶B免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备抗尿素酶B的mAb,用间接ELISA检测mAb的特异性和亲和力,检测mAb腹水效价,鉴定Ig亚类并测定其抗原决定簇。结果:获得8株能稳定分泌抗尿素酶B的mAb杂交瘤细胞系,这8株单抗与能产生尿素酶的小肠结肠耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌和普通变形杆菌均无交叉反应,相对亲和力为1.13×10-8～4.66×10-10,腹水mAb效价可达2×104～3.2×105。其中2株单抗属IgG1亚类,3株单抗属IgG2a亚类。8株单抗分属于3种不同的抗原决定簇。结论:获得了IgG1和IgG2a类型的针对3种不同抗原决定簇的特异性幽门螺杆菌尿素酶B的mAb,为进一步用于幽门螺杆菌的临床诊断和实验研究创造了条件。     

口服幽门螺杆菌疫苗候选株对小鼠肠道菌群的影响

目的:考察口服幽门螺杆菌疫苗候选株SH02对小鼠肠道菌群的影响。方法:采用PCR扩增的方法检测疫苗用载体菌侵袭性相关基因缺失状况,用豚鼠角结膜侵袭试验进一步确证其是否具有上皮细胞侵袭能力;用小鼠口服灌胃的方式检测SH02在小鼠体内的组织分布,在肠道的存留时间与活菌数;取小鼠灌胃前(0 d)和灌胃后(2、8 d)的粪便样本,提取基因组DNA,用细菌16S r RNA基因高通量测序的方式,分析评价口服幽门螺杆菌疫苗候选株SH02对小鼠肠道正常菌群的影响。结果:载体菌FWL01侵袭性相关基因缺失,不具有对上皮细胞的侵袭能力;SH02经口服灌胃小鼠后不能侵入机体组织内部,仅在小鼠肠道可以检测到疫苗株活菌,灌胃后24、48 h肠道粪便中活菌数分别为1.19×10~5和2.42×10~3CFU/g,72和96 h在小鼠肠道粪便中没有检测到SH02活菌存在;细菌16S r RNA基因高通量测序与分析结果表明,口服幽门螺杆菌疫苗候选株SH02对小鼠肠道菌群不会产生明显的影响。结论:口服幽门螺杆菌疫苗候选株SH02对小鼠肠道正常菌群没有明显影响。     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌：DH5α,用5′端与组氨酸基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大肠杆菌及其他菌株中快速、精确的构建营养缺陷型菌株提供了有益的参考。     

一种KBMA炭疽疫苗候选株的研制

炭疽病是由炭疽芽胞杆菌Bacillus anthracis引起的一种人畜共患传染病,严重影响着人类的健康。近年来在细菌疫苗的研究中发现一种特殊的现象：细菌被杀死后,体内的代谢活性却仍然维持 (Killed but metabolically active,KBMA)。此发现为炭疽新型疫苗候选株的研制提供了新思路。先通过同源重组的方法,利用pMAD质粒和Cre-loxP重组酶系统完成对缺失两个毒性大质粒的炭疽芽胞杆菌减毒株AP422的uvrAB基因的敲除,得到AP422△uvrAB菌株,然后通过光化学处理 (包括长波紫外光的照射和8-甲氧基补骨脂素处理),使炭疽芽胞杆菌AP422△uvrAB失去繁殖能力。利用四氮唑化合物MTS检测其代谢活性,表明光化学处理杀死后的炭疽芽胞杆菌AP422△uvrAB在至少4 h内维持一个很高的代谢活性水平,即具备典型的KBMA特性。炭疽杆菌AP422 △uvrAB的KBMA菌株的成功研制为我们提供了一种新型炭疽疫苗候选株。     

炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

目的:通过同源重组的方法敲除炭疽芽胞杆菌减毒AP422株的mntA基因,使菌株进一步减毒,用于构建新的疫苗候选株。方法:利用PCR方法扩增mntA基因上下游同源臂后与温敏质粒连接,构建打靶载体,并转化炭疽芽胞杆菌减毒AP422株;利用抗生素和温度2种选择压力实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-LoxP系统去除抗性筛选标记,得到无抗性标记的缺失突变株,并利用PCR和Western印迹等方法对重组菌进行系统鉴定,最后分析突变株的生物学性状。结果:敲除了AP422株的mntA基因,获得了无抗性标记的缺失突变株,突变株的生存竞争能力比原始菌株明显减弱。结论:突变株获得了进一步减毒,可用于构建新的疫苗候选株。     

鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统的构建

为了比较不同锚钩蛋白基序结合活性,构建新型的鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统。首先,用热酸处理法制备鼠李糖乳杆菌GEM(Gram-positive enhancer matrix,GEM)颗粒,并通过电镜观察、RT-PCR检测和SDS-PAGE检测鉴定其处理效果;同时,利用大肠杆菌表达了锚定蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP并将其与GEM颗粒共同孵育结合;最后,使用免疫印迹、电镜观察、荧光显微镜观察和荧光分光光度法评价鼠李糖乳杆菌GEM颗粒与锚定蛋白的结合效率。结果表明,使用10%的TCA处理鼠李糖乳杆菌得到了灭活的肽聚糖骨架(GEM颗粒),经鉴定其大小形态均一,绝大部分无蛋白残留,3.8×10~6个GEM颗粒样品中的DNA拷贝数仅为32;免疫印迹和荧光显微镜观察均可检测到融合蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP锚定在GEM颗粒上,且结合在GEM颗粒表面的锚定蛋白呈絮状。荧光分光光度计法检测结果显示锚定蛋白PA3-EGFP结合GEM的效率稍高于P60-EGFP,但差异不显著(P0.05)。以上结果表明由鼠李糖乳杆菌制得的GEM颗粒与锚定蛋白PA3、P60的结合效率良好,可用于构建新型的外源蛋白表面展示系统,进而为后续的细菌样颗粒疫苗的研究与应用奠定基础。     

幽门螺杆菌Ure B串联融合表位的表面呈现表达

目的:应用表达载体pHIE3N表面呈现表达幽门螺杆菌Ure B串联融合表位。方法:通过引入多克隆位点的方法改造表达呈现表达载体pHIE11,并用改造后的质粒表达幽门螺杆菌Ure B串联融合表位,用SDS-PAGE、Western blot和全菌ELISA检测所得到的重组菌。结果:改造的质粒插入序列正确,能够特异性呈现表达Ure B串联融合表位,表达产物的分子量约为60kDa,与预期大小一致。全菌ELISA结果表明Ure B串联融合表位表达于菌体表面。结论:pHIE3N载体能够表面展示呈现Ure B串联融合表位,构建的重组菌为幽门螺杆菌候选疫苗的研发奠定了基础。     

蛇毒类凝血酶Calobin cDNA的设计合成与克隆

人工合成了朝鲜蝮蛇(Agkistrodon cnliginosus)类凝血酶Calobin的编码序列。在设计引物时选择大肠杆菌和酵母茵的偏爱密码子,通过相互搭桥的方式,将全长为789bp的编码序列分成14个片段,每个片段长度为78个碱基左右,采用“核心模板法”并加以改进,通过4次PCR延伸反应,得到了全长基因。经扩增后回收目的片段,双酶切后连接到克隆载体,将得到的转化子酶切鉴定后,任意选择6个克隆进行双向测序,得到了全序列正确的3个克隆。本工作为类凝血酶在大肠杆菌和酵母系统中的高效表达奠定了基础,也为长度为700-900bp片段的合成提供了帮助。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水甲和蛋白质水半进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

利用λ-Red重组系统和平衡致死系统改造抗药性致腹泻工程疫苗

质粒pMM085是含有猪毒素源性大肠杆菌(ETEC)的黏附素K88与无毒肠毒素LTA-B 基因的重组质粒,含氯霉素抗性基因,由此构建的菌苗株带有抗药性。利用平衡致死系统改建此疫苗株,即将质粒上的氯霉素抗性基因cat替换成asd基因,并把新构建的质粒转移到缺失asd基因的大肠杆菌X6097中。但由于质粒pMM085是一个23kD的大质粒,传统的基因工程操作不易进行,利用λ-Red重组系统,将表达Red重组蛋白的质粒pKD46转化含pMM085的大肠杆菌X6097,并用两端各带有39ntcat基因同源区、含全长asd基因的PCR产物电击转化此感受态细胞,在λ-Red重组系统的帮助下,成功实现了asd基因对cat基因的置换。