表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选

构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒,并对其进行鉴定。首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-HIV gag。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR,RT-PCR,Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中,RT-PCR,Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次,PCR,RT-PCR,Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,而且病毒已经纯化。结论:成功获得表达HIV-1gag的重组鸡痘病毒,为进一步免疫试验研究奠定基础。     

耐辐射的产黑色素酵母状真菌

从1945年7月美国第一次核试验至今,全世界已进行了几千次的核试验,对周边环境造成了不同程度的污染,对人类及其生存环境造成了极大危害。而耐辐射微生物因其惊人的耐辐射能力,以及特殊的生命现象和生理机制,使其不仅成为研究生命起源、物种进化等理论科学的重要材料,而且也在环境工程、人类健康、生物技术等方面具有极大的应用前景,从而成为世界各国竞相发掘的重要资源。     

河南新乡黄河湿地鸟类国家级自然保护区苍鹭巢特征与巢址选择

河南新乡黄河湿地鸟类国家级自然保护区是我国候鸟迁徙中线的必经之路,鸟类物种丰富。目前,该湿地的人为干扰现象日益突出,对鸟类栖息和繁殖造成了影响。苍鹭Ardea cinerea是该湿地鸟类的重要代表,其繁殖活动与栖息环境密切相关。为了解干扰鸟类繁殖的主要因素、有效管理保护区、维持湿地的鸟类多样性,于2017年5—8月,采用GPS定位、样方调查等方法对保护区陈桥东湖苍鹭繁殖地内的巢特征、巢址区和对照区生态因子进行了调查。研究结果表明:苍鹭筑巢位置对芦苇phragmites australis丛有极高的偏爱;巢材主要是芦苇;巢口向上呈浅盘状,巢内径、巢外径、巢高、巢深分别为(39.00±3.28)cm、(79.10±15.39)cm、(31.00±19.80)cm和(5.00±1.43)cm。对比苍鹭巢址区与对照区生态因子发现,巢址区植被密度、植被高度和植被盖度显著低于对照区(P0.05);水深、巢距人为活动不频繁地距离和巢距人为活动频繁地距离显著高于对照区(P0.05)。采用AIC信息准则法对可能影响苍鹭巢址选择的生态因子进行Logistic回归分析,结果发现,植被状态和干扰因子是制约苍鹭巢址选择的关键因素。建议通过采取适当扩大水域面积及水生植物面积、封锁湿地中的道路、定期蓄水、处理好湿地保护与旅游开发之间的关系等措施来改善苍鹭等鸟类的栖息环境,保护保护区鸟类多样性。     

醋酸纤维素膜为基础的葡萄糖生物传感器的研制

用共价法将酶固定在醋酸纤维素膜上,方法简便易行,制造的酶膜稳定,比活力高。同时采用该方法制备了葡萄糖氧化酶酶膜,与氧电极组装成测定葡萄糖的生物传感器,线性范围为50~800mg／dl,仪器工作的最适pH为6．0,最适温度为40℃。将该膜与过氧化氢电极组装得到的传感器具有以下特性：线性范围为10~200mg／dl,最适pH为6．0,测定结果与酶试制盒有良好相关性。     

无机离子和有机溶质对α-淀粉酶热稳定性的影响

长期以来,如何提高酶蛋白的热稳定性是分子生物学、生物工程学、化学工业等所关注的重要研究课题之一。分析了多种无机离子、糖和氨基酸对枯草杆菌液化型α-淀粉酶热稳定性的影响以及它们的共存效应,获取了一些对相关研究领域具有理论参考和实际应用价值的实验结果。在无机盐中,1mmol/L的钙离子或50mmol/L的钠离子能显著地提高该酶的热稳定性;酸性氨基酸和碱性氨基酸表现出相反的结果：酸性氨基酸具有明显的增强作用,碱性氨基酸却使之降低;随着糖浓度的增加（0～1000mmol/L）,该淀粉酶的热稳定性呈线性增高;当钠离子或钾离子与某些氨基酸或糖类共同存在时,对该淀粉酶的热稳定性表现出了明显的协同作用。试图通过检测酶蛋白分子荧光强度改变来反映该酶的热稳定性变化,其结果是：随着温度的改变,酶蛋白的荧光强度的衰减与残余酶活性之间显示了良好的相关性。从而说明热环境使酶蛋白分子的螺旋结构发生变化而失活,某些溶质的存在可能是通过作用于蛋白质分子的立体结构而影响该酶的热稳定性。     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及分子进化分析

根据已发表的鸡白介素18(IL-18)基因序列设计合成引物,以植物凝集素(PHA)和脂多糖(LPS)激活的AA肉鸡脾细胞mRNA为模板,通过RT-PCR扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白的eDNA。将该eDNA克隆于pUCm-T载体,并对其进行测序,结果表明所克隆的核苷酸片段包含了全部成熟蛋白编码基因,成熟蛋白编码区507个核苷酸,编码169个氧基酸。把该基因编码的鸡成熟IL-18蛋白氨基酸序列与已公布的禽及哺乳动物IL-8成熟蛋白基因氧基酸序列进行比较,其同源性分别在96．5％～100％和20．1％～26．6％之间,分子系统进化树分析表明鸡IL-18与哺乳动物IL-18有共同的祖先,亲源关系较近,但在免疫系统选择性压力下,形成独特的种族特异性。鸡IL-18基因的克隆为体外表达鸡IL-18蛋白及作为免疫佐剂应用于预防接种的研究奠定了基础。     

杂拟谷盗的热适应特性

为了解杂拟谷盗Tribolium confusum Jacquelin du Val的热适应特性,将杂拟谷盗分别于15,25和35℃下驯化2周后,用温度梯度仪测量在不同温度驯化下杂拟谷盗的最适温度、临界低温和临界高温。结果表明,驯化温度对杂拟谷盗最适温度、临界低温和临界高温的影响极显著(P<0.01),最适温度、临界低温、临界高温均随着驯化温度的升高而升高。最适温区的范围随着驯化温度的升高而扩大。驯化温度对杂拟谷盗最适温度的影响最大(0.317),对临界低温的影响(0.310)大于临界高温(0.255)。     

SARS-CoV核衣壳蛋白的表达与免疫研究

依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成编码SARS病毒N蛋白的全基因(1296bp)序 列,再与设计的CTL特异性表位基因(195bp)重组后,克隆到pET-28a( )质粒中,重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达。利用SARS患者恢复期阳性血清,鉴定表达蛋白。进一步纯化后免疫马,并用ELISA方法检 测血清抗体效价。结果显示SDS-PAGE表明所表达的蛋白相对分子质量约为55000 Da,与预计大小相符;Western blot显示表达的蛋白具有良好的抗原性和特异性。对表达蛋白形成的包涵体进行洗涤,得到的蛋白纯度可达到 70．1％。切胶纯化免疫马后,获得的抗SARS抗体滴度达1:2560。为亚单位疫苗研制和精制抗SARS抗体免疫制 剂提供基础。     

小鼠beta-防御素2真核表达载体的构建及表达

构建小鼠heta-防御素2(murie beta-defensin 2,mBD2)的真核表达载体pcDNA-mBD2,并观察其在真核细胞中的表达.从小鼠肝组织中提取mRNA通过逆转录聚合酶链反应扩增得到mBD2基因,定向克隆至真核表达栽体pcDNA3.1(+)获得pcDNA-mBD2;经酶切和测序鉴定构建正确,应用脂质体法转染siha细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内mBD2的表达.结果显示,构建了小鼠mBD2的真核表达载体,转染siha细胞培养并采用G418稳定筛选后,获得稳定转染细胞,收集并裂解转染细胞,蛋白免疫印迹法检测到转染细胞内mBD2的表达.成功构建了真核表达裁体pcDNA-mBD2,为研究mBD2在宫颈癌发生发展过程中的作用及作用机制奠定基础.