宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL（BLCAP）SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32（a）中,从而构建原核表达重组质粒pET-32（a）-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化回收,并采用SDS—PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32（a）-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

用λZAP Express作载体构建金针菇子实体表达型cDNA文库

采用QuickPrep micro mRNA Purification 试剂盒从新鲜金针菇子实体中快速提取、纯化mRNA,Time Saver cDNA Synthesis试剂盒逆转录成cDNA分子后,通过在cDNA分子两端加上EcoRⅠ/NotⅠ接头,在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化,与表达载体λZAP Express Predigested Vector连接,然后用包装蛋白在体外包装连接产物,感染E.coli XL1-Blue MRF'构建成表达cDNA文库.经检测文库滴度为4.0×106 pfu/ml,文库扩增后,滴度达2.0×1010 pfu/ml,重组率为90%,cDNA分子长度在0.3-3.5 Kb范围.应用原位免疫杂交,初步筛选出火菇素相关基因的阳性克隆.     

TAT-凋亡素融合蛋白的表达及其抗肿瘤活性

凋亡素(apoptin)由鸡贫血病毒vp3基因编码,能特异地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞 没有毒性,为了获得可转导入细胞内部的凋亡素,将人工合成的编码TAT蛋白转导结构域的DNA片段与凋亡素编码基因克隆入质粒pET-28a内,构建出表达融合蛋白TAT-apoptin的原核表达载体pET-28a-TAT-apoptin.在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达融合蛋白,利用IDA -Ni2+ 亲和柱纯化,葡聚糖凝胶G 25除去尿素后得到可溶的变性蛋白.纯化后的TAT apoptin加入体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人肺癌Anip973细胞,对照组加入TAT-麦芽糖结合蛋白（TAT-MBP）. 经免疫组化检测,转导1 h后TAT-MBP分布于以上两种细胞的胞浆和胞核,TAT-apoptin则主要分布于2种细胞的胞浆内,转导24 h后TAT-MBP的亚细胞定位没有变化,TAT-apoptin分别定位于HUVECs的胞浆和Anip973的胞核中.脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）显示转导48 h后,TAT-MBP处理过的 HUVECs和Anip973细胞、TAT-apoptin处理过的HUVECs没有明显改变,而TAT-apoptin处理过的Anip973细胞大量凋亡.以上结果表明TAT apoptin融合蛋白在肿瘤治疗上有潜在的应用价值.     

亚麻籽油的营养特性研究进展

亚麻籽油的营养价值已得到普遍认可,对于其功效及作用机制分别以人或动物为实验对象开展了广泛的研究.本文首先对油脂风味、脂肪酸组成、微量营养成分和氧化稳定性四个影响亚麻籽油营养价值的因素进行了阐述,在此基础上重点综述了亚麻籽油在降血脂、降血压、降血糖、改善认知功能和改善眼睛疾病等方面的最新研究进展.     

湖北地区宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的分离、克隆和序列分析

采用加端聚合酶链反应技术,从湖北地区一宫颈癌患者癌组织ＤＮＡ中分离出人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因,并在ｐＵＣ１８载体中克隆。经限制性核酸内切酶分析和ＤＮＡ序列分析,确认了含ＨＰＶ１６Ｅ７重组克隆质粒,命名ｐＨＰＶ１６Ｅ７─ＨＢ。ＤＮＡ序列分析表明,ＨＰＶ１６Ｅ７─ＨＢ基因全长２９４ｂｐ（与报道的标准株基因长度相同）,但其核苷酸顺序中有两处发生了Ｃ→Ｔ突变,即第４３位密码子ＣＡＡ变为ＴＡＡ,第７６位ＣＧＴ变为ＴＧＴ;前者使谷氨酰胺密码子变为终止密码,即无义奕变（ｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎ）。这种突变发生在２９４个碱基的ＤＮＡ扩增产物之中,不像是ＰＣＲ本身的错配,而很可能是湖北株与标准株之间的结构差异。     

猪脂肪前体细胞分化过程中聚脂相关基因的表达模式

本实验采用胶原酶消化法分离猪皮下脂肪前体细胞,用含850 nmol/L 胰岛素和50 nmol/L地塞米松的诱导培养液进行诱导,采用油红O提取法测定了细胞中的甘油三酯含量,同时采用实时定量RT-PCR方法检测了细胞分化过程中聚脂相关基因的表达.结果显示:转录因子PPAR γ和C/EBP β在诱导后12 h即迅速表达,SREBP-1 mRNA表达水平在诱导后12 h出现显著下调,随后逐渐升高,96 h达到最高水平;脂肪合成相关酶基因GPDH、FAS、ACC和LPL呈现出与SREBP-1相似的表达模式;脂肪酸转运相关基因aP2、FAT、FATP1与VLDLR的表达量随着细胞分化过程的延长而不断增加,并且与细胞内甘油三酯的含量变化高度相关.本实验结果表明,PPAR γ、C/EBP β和SREBP-1可能是调控猪脂肪前体细胞分化的关键转录因子.猪皮下脂肪组织在聚脂过程中,在分化早期可能以脂肪细胞自身合成脂肪酸为主,而后期则主要依赖细胞外脂肪酸的跨膜转运.这些结果可能有助于揭示脂肪细胞的分化调控规律.     

一株来自蚯蚓的产纤溶酶蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的筛选及鉴定

对来自4个不同省份的5条蚯蚓的肠道及体表细菌进行分离,共获得122株细菌。通过脱脂奶粉平板法初筛,纤维蛋白平板法复筛,以透明圈为筛选标记,共筛选出产纤溶酶菌株12株,其中菌株SC-3-W-3的纤溶酶活力较高,达到了538.64 U/mL(相当于尿激酶的活力单位)。通过对其形态、培养、生理生化特征进行研究,发现其与蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus Frankland的特征很相符。进一步对SC-3-W-3的16S rDNA序列及系统发育分析表明,该菌株与蜡状芽孢杆菌的同源性高达100%。综合生理生化及16S rDNA序列比对结果,将SC-3-W-3菌株鉴定为蜡状芽孢杆菌。     

基于实测光谱混合像元分解的苹果园地遥感提取技术

以山东省栖霞市为研究区,对苹果花期的TM影像进行混合像元分解,提取苹果园地信息.基于实测地物光谱端元,利用小波变换对线性分解模型进行改进,采用实测端元改进后线性分解模型、实测端元线性分解模型、TM影像端元线性分解模型分别提取研究区苹果园地信息,并以ALOS数据进行精度评价.结果表明:经过精确的大气及地形校正后,可以利用实测光谱端元进行混合像元分解,面积精度＞97％,对丰度图像的归一化植被指数(NDVI)值与ALOS数据的平均NDVI值进行回归分析,R2＞0.8;利用小波变换对线性分解模型进行改进,可在一定程度上提高分解精度.     

人乳头瘤病毒16型E7变异株免疫原性研究

采用分子克隆技术,构建E7变异株重组质粒[pcDNA3．1-(by)E7]和E7标准株重组质粒【pcDNA3．1．(ys)-E7】,并将两种质粒分别皮下免疫Balb／c小鼠,免疫后于不同时间提取小鼠血清和制备脾淋巴细胞悬液,分别用ELISA法和MTT比色法检测特异性抗体和特异性淋巴细胞增殖反应。基因免疫后,ELISA法显示,HPVl6E7变异株和标准株均能诱导特异性抗E7抗体;MTTT比色法显示,E7标准株免疫组脾淋巴细胞在体外受到变异株E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应,变异株E7免疫组脾淋巴细胞经过同样处理后,出现非特异性淋巴细胞增殖反应。结果表明HPV16E7变异株能诱导特异性体液免疫应答而不能诱导特异性细胞免疫应答,HPVl6E7变异株无论在结构还是免疫原性上均与标准株有差异。由此推测,HPV16E7变异可能导致其逃逸机体自然感染或疫苗诱导的免疫应答。用基因免疫方法研究E7变异株免疫原性也为其它不能或难以进行体外培养的病毒变异研究提供借鉴。     

S-腺苷甲硫氨酸的细胞生物化学功能及其开发应用研究

综述了生物体内一种重要的代谢中间体S-腺苷甲硫氨酸的生物学功能,并介绍了其生产制备和临床应用的进展。