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汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
从汉坦病毒陈株感染的VeroE6细胞裂解液中提取病毒RNA,经逆转录PCR获得病毒S基因编码区约1.3kbcDNA片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒76118株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为97%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX4T1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为GSTNP融合蛋白。SDSPAGE检测表达蛋白分子约72kD左右。Westernbloting和ELISA试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的McAb发生反应,其抗原表位及McAb反应谱与76118株相比存在某些差异。 相似文献
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以pBRTM/HCV-3011模板,通过PCR法扩增ns5a、LISDR(左端序列)和RISDR(右端序列),分别经XhoⅠ/EcoRⅠ、XhoⅠ/HindⅢ和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切,连入穿梭质粒pEGFP-N3中,构建重组质粒pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-ΔISDR。对重组质粒进行酶切分析和序列测定。将这2种重组质粒通过电穿孔法转染HeLa细胞,然后在G418选择压力下进行有限稀释法筛选,用RT-PCR和荧光显微镜鉴定。经酶切鉴定和基因测序证实,重组穿梭质粒已插入目的片段ns5a、LISDR和RISDR。RT-PCR和荧光显微镜检测到目的基因的表达。以上结果说明成功构建了真核表达载体pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-ΔISDR,目的基因在HeLa细胞中得到表达,为研究HCVNS5A中是否存在抗干扰素治疗的功能蛋白提供了实验材料。 相似文献
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静态强磁场对枯草芽胞杆菌的影响研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:研究静态强磁场下微生物的生物学效应.方法:以超导磁体产生的静态强磁场为基础,枯草芽孢杆菌为模式生物,通过测定生长曲线、芽胞生成率、蛋白酶表达量、蛋白酶活力等研究静态强磁场条件下微生物性状的变化.结果:强磁场可以影响枯草芽胞杆菌的芽胞形成速率,抑制营养体的死亡;测定菌体生长过程中蛋白酶的含量以及碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活力,发现磁场处理前后蛋白酶的含量没有发生显著性变化,处理组碱性蛋白酶的酶活力明显高于对照组,而中性蛋白酶酶活力则低于对照组.结论:强磁场可以延长枯草芽孢杆菌的世代周期,降低菌体死亡率,对细菌酶活性的影响因酶的种类不同而异. 相似文献
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本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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目的:探讨肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-α)对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs)成骨分化的影响。方法:以在促成骨分化培养基(Osteogenic media, OS)中培养的小鼠BM-MSCs作为对照,用含有TNF-α的OS处理小鼠BM-MSCs。第7天进行碱性磷酸酶染色,或培养第21天进行茜素红染色和定量分析。第7天时用一份细胞提取得到的mRNA通过实时定量RT-PCR测定Runx2和Osterix的mRNA表达,用另一份细胞得到的细胞裂解液通过SDS-PAGE来测定Runx2和Osterix的蛋白质表达。结果:TNF-α抑制碱性磷酸酶活性;TNF-α抑制矿化骨节的形成; TNF-α抑制Runx2和Osterix的mRNA和蛋白质表达。结论:TNF-α对小鼠BM-MSCs成骨分化的抑制,可能部分是通过抑制成骨分化中两个关键的转录因子Runx2和Osterix的mRNA和蛋白质表达来实现的。 相似文献
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用低分子量的聚乙亚胺(PEI)开发一种新的非病毒基因转染系统,为基因在皮肤组织中的有效转染提供一种可靠、廉价的方法。将带有绿色荧光蛋白报告基因 (gfp) 的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺结合,用肝癌细胞株CM7721试验,研究其转染效率及可能引起的细胞毒性;进一步转染小鼠皮肤组织,研究转染基因的表达位置及持续表达时间。结果发现,低分子量PEI介导的细胞转染效率最高可达55%,转染效率与PEI结构无关(P>0.05),但是随着PEI分子量的增加,其转染活性略有下降。同时,随着分子量的增加,PEI对细胞的毒性也相应加大;小鼠皮肤转染实验显示,转染24h后,gfp即可在皮肤组织的毛囊、汗腺、皮脂腺等处高效表达,表达可持续7~9d;进一步对皮肤用氮酮、维甲酸处理后,gfp可在皮肤组织的颗粒层细胞中高效表达。PEI是一种高效、有用的非病毒基因转染载体,能够在体外培养的动物细胞及动物皮肤组织中进行基因转移,这对皮肤疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。 相似文献
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在大肠杆菌中对汉滩病毒S基因4种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达。结果表明表达的4种GST-NP融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于茵体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的29-36%,分子量分别约为72kD、66kD、54kD和44kDD。Western blot显示54kD和72kD融合蛋白用酶标记汉滩病毒NPMcAblA8和抗GST McAb 3C11染色呈阳反应。66kD和44kD融合蛋 相似文献