转异源chi基因的Bt工程菌株的生防潜力评价

【目的】构建增强抑制真菌能力兼杀虫的苏云金芽胞杆菌多功能生防菌株。【方法】将含有组成型高效表达启动子、地衣芽胞杆菌chi MY基因的重组质粒p DM,转化进杀虫活性高且有一定抑菌活性的Bt519-1菌株。酶谱分析方法确认Bt519(p DM)组成型异源表达几丁质酶。室内测定工程菌株抑菌谱,计算抑菌效率,确定最敏感的植物病原真菌,进行植物盆栽病害防治的应用潜力评价。将不同浓度的Bt粗酶液灌入甜椒幼苗根部,12 h后接种辣椒疫霉孢子液,接种2 d后开始观察,记录发病株数。自7 d起调查植株发病情况统计并分析防治效果。【结果】SDS-PAGE及酶谱分析证明,Bt519(p DM)能够特异表达68 k D蛋白,该蛋白为异源几丁质酶Chi MY。抑菌谱测定证明,工程菌抑制效率达到90%以上的有5种真菌,其中最明显的是辣椒疫霉。盆栽实验证明,Bt519(p DM)7 d的防效为73.2%。工程菌株对棉铃虫的半致死浓度(LC50)为121.26 mg/L。【结论】Bt519(p DM)是一株有应用潜力的生防菌株。     

Bt9816C培养上清中杀虫活性成分的研究

Bt9816C的培养上清对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。热敏实验表明β-外毒素和Zwittennicin A不是其主要杀虫活性成分。Bt9816C的无晶体株保留有卵磷酯酶C和溶血素活性,但是不再具有vip3A基因,其培养上清也丧失了杀虫活性。SDS-PAGE结果显示Bt9816C培养上清中有vip3A蛋白特征大小的89kD的蛋白,而其无晶体株正好缺失了该蛋白。以上结果表明Bt9816C培养上清中主要的杀虫活性成分是VipaA蛋白。     

蝶蛹金小蜂寄生对菜粉蝶体液免疫反应的影响(英文)

以蝶蛹金小蜂及其寄主菜粉蝶为研究对象 ,研究了内寄生蜂对寄主体液免疫反应的影响。当寄主蛹被寄生后 1 2h或第 4和 5d时 ,血淋巴中酚氧化酶活性明显增高。寄生蛹血淋巴中血细胞凝集素活性始终高于针刺和未寄生蛹 ;同样 ,寄生蛹血淋巴的抗菌活性也明显增强 ,而后两者处理蛹的活性则很微弱。由此可知 ,该蜂寄生能引起寄主体液免疫因子活性的不同程度的变化     

组成型表达chi基因的Bt工程菌株构建及其特性

【目的】通过构建能够组成型高效表达几丁质酶的苏云金芽胞杆菌工程菌株,以提高其抑真菌活性。【方法】首先通过PCR扩增获得Bti75菌株chiB全长及系列缺失启动子片段,与本室构建的启动子探测型载体pCB连接,转化Bti75菌株,通过β-半乳糖苷酶活性检测及β-半乳糖苷酶mRNA的Real time-PCR检测,确定了一段长度为190 bp的组成型高效表达启动子。将这一启动子分别与Bti75自身几丁质酶基因chiA以及地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的几丁质酶基因chiMY连接构建了组成型高效表达的工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)。应用几丁质酶酶活检测、SDS-PAGE及酶谱分析检测了工程菌几丁质酶的表达情况。最后,通过检测工程菌发酵粗酶液对真菌孢子萌发和菌丝生长的影响,评估了工程菌对3种植物病原真菌的抗真菌活性。【结果】在没有诱导物存在的情况下,Bti75(pBPΔ7)菌株表达的β-半乳糖苷酶酶活和β-半乳糖苷酶mRNA的转录量分别是Bti75(pBP)菌株的7倍和2.5倍左右。在没有几丁质诱导的情况下,与野生株Bti75相比,工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)的几丁质酶活性均提高了3.5倍左右。SDS-PAGE及酶谱分析证明目的几丁质酶在非诱导条件下达到组成型高效表达,抑真菌实验显示工程菌Bti75(pDA)和Bti75(pDM)抑制3种植物病原真菌的活性明显提高。【结论】发现190 bp的缺失启动子能够组成型高效表达不同来源的几丁质酶,无需诱导物的诱导,工程菌株就能展现良好的抗真菌能力。     

苏云金芽胞杆菌几丁质酶B特性及其杀虫抑真菌的作用

摘要：【目的】本文对苏云金芽胞杆菌科默尔亚种15A3菌株（Bacillus thuringensis subsp.colmeri 15A3,简称Bt 15A3）几丁质酶B（chitinase B,简称ChiB）的特性及其杀虫抑真菌作用作了初步研究。【方法】将大肠杆菌（Escherichia coli）中表达的Bt 15A3菌株的ChiB,经过硫酸铵沉淀、透析、Sephadex G-200凝胶层析,最终得到初步纯化的几丁质酶。利用酶谱方法确定分子量,并且对2种分子量的酶蛋白进行了质谱鉴定。对各种金属离子对ChiB酶活的影响、最适反应温度及pH、温度及pH稳定性等理化特性进行研究,并且测定了ChiB抑制真菌孢子萌发的活性和对甜菜夜蛾和棉铃虫的杀虫增效作用。【结果】ChiB分子量约为70 kDa。同时证明检测到的64 kDa蛋白为70 kDa蛋白C端的降解产物。ChiB最适作用温度为60 ℃,最适pH值为5,在温度20 ℃～60 ℃和pH 4-8的范围内均有良好的稳定性。供试金属离子中Fe3+对ChiB的酶活有促进作用,Zn2+,Ag+有抑制作用。ChiB可抑制产黄青霉等真菌孢子的萌发,半抑制浓度（median effective inhibitory concentration,IC50）约为4 μg/mL。该酶可以分别降低Bt晶体蛋白对甜菜夜蛾和棉铃虫的半致死浓度（median lethal concentration,LC50）26 %和30 %。【结论】Bt科默尔亚种的几丁质酶不但具有较稳定的理化性质,而且具有抑制真菌生长及明显的杀虫增效作用。