猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因.本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013 7/mL.用RT-PCR、间接ELISA、Western blot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达.该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M.RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表达M基因的mRNA和M蛋白.纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8TCID50/mL.动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础.     

Ubiquitin基因介导下的PRRSV GP5基因免疫特性研究

目的：探讨泛素基因对GP5基因免疫的影响。泛素-蛋白酶体途径是一种高效蛋白降解途径,主要负责真核细胞内蛋白选择性降解。方法：本研究将ORF5DNA片段克隆到含泛素（Ub）基因的表达载体pCMV-Ub和pCMV载体,构建成重组质粒pCMV—Ub-GP5和pCMV-GP5。两种质粒DNA肌肉注射免疫BALb／c小鼠后,分别检测体液免疫反应和细胞免疫反应,比较GP5单基因和Ub—GP5融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果：二者均可诱生PRRSVELISA抗体和中和抗体,其抗体水平无明显差别,但Ub-GP5融合基因诱生的淋巴细胞反应和CTL反应明显高于GP5基因。结论：泛素基因可以促进GP5诱生细胞免疫反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒华东地区分离株RT-PCR-RFLP分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪的一种重要传染性疾病病原,已给世界养猪业带来了巨大的经济损失.其主要临床表现为妊娠期母猪的早产、流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎,新生仔猪肺炎、生长迟缓.PRRSV为动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员.病毒有囊膜、呈球形,基因组为单股正链RNA,大小约15kb,含有8个开放阅读框(ORF),其中ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码病毒RNA复制酶;ORF2-7分别编码病毒结构蛋白:GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白.     

山东一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与分析

目的:对青岛即墨地区发病的濒死鹦鹉进行诊断,并对BFDV进行全基因测序,分析其遗传进化规律.方法:利用PCR对发病鹦鹉进行BFDV的检测,并设计引物进行BFDV全基因组的测序.结果:BFDV核酸扩增为阳性,经PCR分段扩增法获得全基因组并完成了序列测定.QDJM01株全序列测定结果与GenBank中仅有的七株BFDV全序列进行同源性比较与进化树分析.经BLAST和DNAStar软件分析,QDJM01与其他七株BFDV同源性为99.0%～99.6%,为同一个基因型.结论:此病例为鹦鹉幼雏病病毒感染,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性.     

串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经PacⅠ线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明可以诱导产生较强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。证明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白N端信号肽对其DNA免疫应答的影响

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是近年来引起世界养猪业严重经济损失的重要病原之一,可引起繁殖母猪流产和新生仔猪呼吸道疾病.该病毒属于动脉炎病毒科,有美洲型和欧洲型两种血清型.基因组为单股正链RNA,大小15kb左右,含有9个开放阅读框（ORF）.由ORF5、6和7编码的GP5、M和N蛋白是病毒的主要结构蛋白.